이 프로토콜은 흑색종 전이의 후보 조절자의 생체 내 효과를 평가하는 데 사용할 수있는 연속 워크 플로 내의 일련의 기술뿐만 아니라 다른 고형 악성 종양의 전이를 설명합니다. 우리의 체계적인 워크 플로우의 가장 큰 장점은 강력하고 표준화 된 생체 내 모델 및 기술로 인해 데이터의 재현성이 증가한다는 것입니다. 이 파이프라인은 생체 내 환경에서 Omics 데이터 또는 시험관내 분석으로부터 추론된 후보물질을 시험함으로써 표적 발견 및 치료 개발을 위한 경로를 제공한다.
이 프로토콜에 제시된 기술과 관련된 학습 곡선은 제공된 자료를 사용하고 단계를 연습 할 때 자세한 설명을 수행함으로써 단축됩니다. 이 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 전임상 이미징 코어의 연구 과학자 인 Orlando Aristizabal과 내 실험실의 강사 인 Ran Moubarak입니다. 피내 주사의 경우, 무균 상태를 유지하면서 생물 안전 캐비닛 안에 여덟 ~ 10 주령의 마우스를 마취시키고 면도하십시오.
그런 다음 바늘 찌르기의 궤적에 대해 피부를 뒤로 잡고 수축시키고 6 밀리미터 길이의 31 게이지 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 베벨이 위쪽을 향하게하여 급성 각도로 피부를 부드럽게 뚫습니다. 돔 모양의 바퀴가 관찰 될 때까지 종양 세포 현탁액 30 마이크로 리터를 천천히 주입하십시오. 종양 성장, 체중 감소 및 전반적인 건강 상태의 진행을 모니터링합니다.
이러한 모니터링 세션 중에 캘리퍼로 측정하고 종양의 길이와 너비 치수를 사용하여 부피를 계산하십시오. 심장 내 주사의 경우, 마취 된 마우스를 초음파 기계의 가열 된 플랫폼으로 옮깁니다. 그런 다음 저자 극성 테이프를 사용하여 마우스를 코 원뿔에 고정시킵니다.
직선 면도날 또는 메스 블레이드로 흉부를 면도하고 30도 각도로 기울어 10 % 포비돈 요오드로 절차 영역 주위의 피부를 닦으십시오. 그 후, 마우스 좌측의 흉부 중앙에 초음파 프로브를 위치시켜 배향된 수평 창을 캡처하여 좌심실의 단면도를 얻었다. 프로브의 긴 축을 위쪽으로 향하게 하여 프로브를 50도 각도로 고정하고 가열된 플랫폼을 20도 각도로 고정한 다음 프로브와 지지 프레임을 제자리에 고정합니다.
안전 캐비닛 내부에서 작업하는 동안 30 게이지 한 인치 바늘이있는 투베르쿨린 한 밀리리터 주사기에 세포 현탁액을 그립니다. 주사기에 존재하는 기포를 제거하십시오. 스테레오택틱 인젝터에 주사기를 잠급니다.
그런 다음 초음파 지침에 따라 흉부를 통해 바늘을 심장의 좌심실로 밀어 넣고 종양 세포 현탁액 100 ~ 250 마이크로 리터를 천천히 주입하십시오. 단계적 생존 수술을 위해, 마취된 마우스를 워밍 패드에 올려놓고 10% 포비돈 요오드 용액으로 시술 부위 주위의 피부를 닦으십시오. 멸균 된 개인 보호 장비와 장갑을 착용 한 후 동물의 몸 위에 멸균 드레이프를 놓습니다.
다음으로, 홍채 가위 또는 메스를 사용하여 피부를 절개하여 종양의 가장자리에서 다섯 ~ 일곱 밀리미터의 절제 마진을 유지합니다. 피내 종양의 경우 원주 피부와 함께 종양을 절제하십시오. 피하 종양의 경우 피부 아래의 종양을 해부하고 제거하십시오.
종양 절제 후, 아홉 밀리미터 스테이플링 장치로 상처를 닫으십시오. 생체내 영상화를 위해, 한 밀리리터 인슐린 주사기와 28게이지 바늘로 복강내 주사하여 d-루시페린 기질을 마우스에 투여한 다음, 마우스를 마취시키고 생체발광 이미징 스캐너 내부의 코콘에 넣는다. 초기화를 눌러 계측기를 시작하고 노출 시간을 auto로 설정합니다.
배경 빼기를 위해 빈 이미지를 캡처하려면 가져오기를 클릭하고 수집 순서가 완료된 후 이미지를 저장합니다. 데이터 분석 및 동일한 생체 내 이미징 소프트웨어의 경우 이미지가 저장된 폴더로 이동하여 한 실험에서 모든 마우스의 이미지를 엽니 다. 단위를 광도로 설정하고 그룹 간 신호 정규화를 방해하므로 개인을 나타내는 확인란이 선택되지 않았는지 확인하십시오.
다음으로, 관심 영역 또는 ROI 그리기 도구를 사용하여 뇌 영역에 대한 원형 ROI를 그리고 신체에 대한 직사각형 ROI를 그리며 비특이적 휘도를 방출하는 경향이 있으므로 뇌 ROI의 귀와 코를 제외합니다. 바이어스를 최소화하려면 발광 신호가 겹쳐져 있지 않은 마우스 사진에 ROI를 그린 다음 ROI 측정을 선택하여 신호를 정량화하고 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 관심 있는 신체 영역에서 총 발광 플럭스를 플로팅하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.
소프트웨어를 이용한 NuMA 염색 후, 다른 장기 실질 및 빈 공간을 제외한 모든 NuMA 염색된 세포를 장기 조직 내에 포함하도록 ROI를 그립니다. NuMA 양성 및 NuMA 음성 세포를 분류하는 동시에 각 장기에 대해 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하도록 설정을 조정합니다. 확립된 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 각 샘플에 대한 NuMA 양성 세포의 총 백분율 수를 정량화합니다.
생체발광, 밝은 장, 생체외 형광 및 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지는 흑색종 전이에 대한 후보 유전자의 분석을 위한 다각적 접근법을 예시한다. Fucosyltransferase 침묵은 흑색종 세포의 전이성 보급을 손상시켰다. 대조군 린다 바이러스에 감염된 흑색종 세포의 NuMA 염색된 폐 절편과 린다 바이러스를 발현하는 전이 억제인자가 여기에 제시되어 있다.
전이성 흑색종 세포는 녹색으로 표시되고 장기 영역은 녹색 부화 선으로 구분됩니다. 피내 주사를 할 때 피부에 적절한 긴장을 유지하고, 주사기를 준비 할 때 공기 색전증을 피하고, 동물의 움직임을 방해하거나 상처 합병증을 유발해서는 안되는 적절한 절제 마진을 얻으면 성공률과 재현성을 향상시키는 데 도움이됩니다. 면역 여과를 검사하기 위한 멀티플렉스 이미징의 추가 고용, 유전자 발현 분석을 위한 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 공간 전사체학은 모두 종양내 이질성을 검사할 수 있는 보완적인 방법을 제공할 수 있다.
이 프로토콜에 설명 된 기술의 조합은 신경 염증을 억제하고 뇌 전이를 촉진하는 흑색종 분비 아밀로이드 베타의 역할과 같은 흑색종 뇌 전이에서 새로운 조절자를 식별하는 데 도움이되었습니다.
