이 프로토콜을 사용하면 평면 방향으로 원시 심내막을 분석 할 수 있습니다. 우리는 심내막 세포의 분포, 다른 금지 명령의 이방성을 분석하고 판막 발달 중 단일 심내막 세포의 모양을 설명 할 수 있습니다. 고전적인 조직 절편과 비교하여 내부 판막 재생 영역의 얼굴 이미징을 통해 손상되지 않은 배아에서 판막 발달 중 평면 세포 극성 및 심내막 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.
이 방법은 심장 발달 동안 평면 세포 극성에 대한 지식을 심화시키는 데 사용할 수 있습니다. 안락사 된 임신 한 마우스에서 절제 한 자궁을 얼음처럼 차가운 PBT가 들어있는 페트리 접시에 넣는 것으로 시작하십시오. 미세한 집게를 사용하여 해부 현미경으로 자궁에서 개별 deciduye를 제거하십시오.
가는 핀셋을 사용하여 배아가있는 decidua의 흰색 부분을 절개하십시오. 부드럽게 제거하고 당기지 말고 끝이 잘린 P-1000을 사용하여 신선한 PBT가 있는 새로운 페트리 접시에 배아를 옮겨 배아가 깨지지 않고 통과할 수 있을 만큼 충분히 큰 직경을 남깁니다. 유전형 분석을 위해 약 0.5 평방 밀리미터의 난황낭 또는 뒤쪽 끝에서 꼬리 조각을 가져 와서 머리쪽으로 5-10 개의 체세포를 세고 적절한 완충액 100 밀리리터로 소화하십시오.
흄 후드 아래에서 섭씨 4도에서 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 배아를 얼음처럼 차가운 4%PFA로 옮깁니다. 배아를 2 시간에서 밤새 섭씨 4도에서 밤새 영양기로 고정하십시오. 흄 후드 아래에서 배아를 건드리지 않고 미세 원심분리기 튜브에서 4%PFA 정착액을 제거합니다.
PFA는 적절한 용기에 넣어 폐기하십시오. 차가운 PBT에서 배아를 실온에서 10 분 동안 5 번 씻으십시오. 가는 집게를 사용하여 심장을 제거하고 새 PBT가 있는 새 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
PBT를 PBS 트리톤으로 교체하고 오비탈 셰이커에서 실온에서 각각 5분씩 샘플을 세 번 세척합니다. PBS 트리톤을 10% 열 불활성화 소 혈청이 함유된 PBS 트리톤이 함유된 블로킹 용액으로 교체합니다. 궤도 셰이커에서 섭씨 4도에서 2 시간에서 밤새 배양하십시오.
블로킹 용액을 원하는 농도의 1차 항체를 함유하는 블로킹 용액으로 대체한다. 섭씨 4도의 궤도 셰이커에서 밤새 배양합니다. 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션한 후, 샘플을 오비탈 쉐이커 상에서 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다.
이 단계는 신호 대 잡음비를 높이는 데 중요합니다. 1차 항체 용액을 제거하고 섭씨 4도에서 최대 3번의 향후 실험까지 유지합니다. 최상의 보존을 위해 아지드화 나트륨을 최종 농도 0.02%까지 첨가하십시오.
이어서, 배아를 PBS 트리톤으로 각각 3분 동안 3회 세척한다. 배아를 PBS Triton으로 30 분 동안 세 번 씻고 섭씨 4 도의 궤도 셰이커에 보관하십시오. 마지막 세척 후, 1차 항체 숙주 종에 대한 형광-접합된 2차 항체를 함유하는 1밀리리터의 블로킹 용액을 첨가한다.
그런 다음 DAPI를 용액에 첨가하고 섭씨 4도의 궤도 셰이커에서 밤새 배아를 배양합니다. 섭씨 4도에서 밤새 배양한 후, 배아를 오비탈 쉐이커 상에서 실온에서 1.5시간 동안 배양한다. 이 단계는 신호 대 잡음비를 높이는 데 필수적입니다.
텍스트 원고에 언급 된대로 PBS 트리톤 세척 단계를 반복하십시오. PBS가 들어있는 35mm 페트리 접시에 하트를 놓습니다. 텅스텐 와이어와 미세한 집게를 사용하여 방실 관 또는 유출관을 분리하고 세로로 자릅니다.
커버 슬립, 슬라이드, 집게, 적절한 팁이 있는 P-200 피펫, 종이 타월 및 DAPI 없이 형광을 위한 수성 글리세롤 기반 장착 매체를 준비합니다. 0.3-0.6cm 떨어진 슬라이드에 두 개의 테이프 스트립을 붙여서 샘플이 찌그러지지 않고 원래 모양을 보존 할 수있는 3D 실내 공간을 만듭니다. 그런 다음 약 20 마이크로리터의 완충액을 사용하여 절단된 P-200 피펫 팁을 사용하여 테이프 스트립 사이의 슬라이드에 샘플을 조심스럽게 떨어뜨립니다.
정확도를 높이려면 해부 현미경을 사용하십시오. 가는 집게를 사용하여 심내막이 위를 향하고 심근이 아래를 향하도록 샘플을 슬라이드에 놓습니다. 종이 타월로 과도한 PBS를 제거하고 샘플을 만지지 마십시오.
그런 다음 샘플을 실온에서 1-2분 동안 건조시켜 샘플이 슬라이드에 달라붙도록 합니다. 40마이크로리터의 수성 기반 장착 매체를 조직에 추가합니다. 두 개의 테이프 위에 커버 슬립을 놓고 바늘이나 집게로 티슈 위로 천천히 내립니다.
기포를 만들지 마십시오. 커버 슬립의 각 꼭지점에 매니큐어 한 방울을 사용하여 커버 슬립을 밀봉합니다. 매니큐어가 마르면 흡수성 종이 타월을 사용하여 커버 슬립 측면에서 여분의 장착 매체를 청소하십시오.
커버 슬립을 움직이지 마십시오. 커버 슬립 가장자리를 따라 매니큐어를 추가하여 완전히 밀봉하여 장착 용지 증발을 방지합니다. 직립 또는 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 일반 보기의 경우 10X 배율로, 자세한 이미지의 경우 3X 줌으로 63X 배율로 이미지를 촬영합니다.
심내막의 세포 모양은 세포 분해능에서 판막이 형성되는 동안 분석되었습니다. 단일 세포 또는 소수의 세포의 클론은 심내막에서 GFP를 발현시켰다. GFP 발현 및 VE-cadherin 세포 내 국소화와의 조합은 AJ 역학과 필로포디아 형성 및 pre-EMT 세포 사이의 관계를 연구하는 효과적인 접근 방식이었습니다.
심내막에서 VE- cadherin 염색의 강도의 차이는 판막 전 단계에서 방실 관의 배아 심내막에 이방성 수축성의 존재를 나타 냈습니다. 전체 심장을 E8.5 및 E9.5에서 VE-카데린 항체로 염색하였다. E8.5에서 방실관의 심내막은 안정적인 상피 조직을 갖는 경향이 있었고 4 개 이상의 세포에 의해 형성된 정점은 검출되지 않았습니다.
E9.5에서 최대 6 개의 세포의 꼭지점이 활성 세포 재 배열을 겪고있는 상피에서 이전에 설명 된 세포 조직과 유사한 로제트 유사 구조를 형성하는 것이 관찰되었으며, 이는 방실 운하 심내막이 판막 발달 중에 역동적 인 세포 재 배열을 겪고 있음을 시사합니다. 이 기술의 전문가가 되려면 학습 곡선이 필요합니다. 또한 소버린 겸자와 텅스텐 와이어를 사용하는 것이 좋습니다.
오늘날, 전 판막 심내막의 시각화는 단면으로 제한되었습니다. 우리의 접근 방식은 평면 관점에서 배아 판막 심내막 행동을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다.
