우리 앤 Laure Duchemin, 데니스 Duchemin, 나탈리 Faggianelli 및 바 실 Gurchenkov 디자인 하 고 만들어서 형이이 프로토콜에서 설명 하는 데 도움 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 유럽 공동체, ERC 장부 N ° 682938, EMBO 젊은 조사 프로그램, ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), FRM (DEQ20140329553)에 의해 지원 되었다 Evalve 그랜트 ANR-10-LABX-0030-INRT에 의해 프랑스 국가 기금에 의해 관리 ANR-10-IDEX-0002-02 프레임 프로그램 Investissements d'Avenir에서 직원 회 드 라 검색 표시.

1. 금형을 준비 하 고 장착 agarose
<ol><li>3D 프린터 또는 전통적인 기계 워크숍 도구를 사용 하 여 그림 1 에 표시 된 치수와 금형을 만듭니다.</li>
	<li>35 m m 플라스틱 마운트 그릇에 녹 인된 1 %agarose 약 1.5 mL를 플라스틱. 형과 agarose 사이 트랩 공기를 피하기 위해 돌보는 액체 agarose에서 플라스틱 금형을 놓습니다. 4 ° C에서 접시를 놓고는 agarose 견고 (약 5 분이이 소요) 때까지 기다려 다음 플라스틱 몰드를 제거 합니다.</li>
	<li>나중에 사용에 대 한 장착 접시를 저장 하는 뚜껑 접시 커버 다음 접시와 뚜껑 parafilm으로 단단히 포장. 장착 요리를 저장할 수 있습니다 다음 뚜껑 면이 아래로 최대 5 일 동안에 4 ° c.</li>
	<li>1.5 mL에 0.7% 낮은 융 점 agarose의 1 mL aliquots Eppendorf 관 장착 당일 사용을 사전에 준비 합니다. 참고: 장착 접시의 agarose 우물 것 이다 변형 시간이 지남에으로 물 증발 parafilm 래핑되지 않은 요리 주위 밀접 하 게 하는 경우.</li>
</ol>2.는 Photoconversion에 대 한 배아를 얻기
<ol><li>Incross Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) 라인과 28.5 ° c.에 어둠 속에서 배아 중간에 약 200 배아를 성장 제 브라 라인을 교차 하는 방법에 자세한 내용은 정돈 과학 교육 데이터베이스11를 참조 하십시오.</li>
	<li>5 h 후만 24 시간 전에 치료 1-페 닐-2-thiourea 색소 형성을 방지 (PTU)와 태아 (0.003% 배아 중간에 통해).</li>
	<li>약 1 h photoconversion, 형광 stereoscope 아래 화면 배아 및 선택 5 건강 한 배아의 시작 하기 전에 나타나는 밝은 녹색 형광을 표현 하. 낮은-강도 빛 머릿속 배아 때의 사용은 photoconverting가 아닌 특정 셀에 피하기 위하여 주변광을 배아의 노출을 피하기 위해 권장 됩니다.</li>
</ol>3. 포함
<ol><li>설치 미디어의 10 mL를 준비: 0.02 %tricaine 및 50 mM BDM 배아 매체에.</li>
	<li>장착 접시를 장착 중간의 2 개 mL를 추가 하 고 솔루션은 agarose로 확산을 위한 15-30 분을 허용.</li>
	<li>한편, 약 5 분 동안 70 ° C 열 블록에 튜브를 삽입 하 여 0.7% 낮은 녹는점 (LMP) agarose의 약 1 mL 수를 녹여.<ol>
<li>약간, 냉각 LMP agarose 기다립니다 다음 낮은 융 점 agarose의 튜브에 8mg/mL tricaine 솔루션의 25 µ L와 1m BDM 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 아래로, pipetting으로 혼합 튜브 LMP agarose 액체 상태로 유지 하는 38 ° C 열 블록에 다음 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>페 트리에서 배아 매체, 신중 하 게 dechorionate와 접시는 배아를 손상 하지 않도록 주의 복용 집게를 사용 하 여 stereomicroscope에서 미리 선택 된 배아.</li>
	<li>미디어를 마운트의 2 개 mL를 포함 하는 별도 접시에는 배아를 전송 합니다.<ol>
<li>배아의 마음은 중지 하는 경우 (약 5-10 분 소요), 장착에 태아 요리 하 고 그들은 25도 각도로 거짓말 집게를 사용 하 우물에 배아 전송 잘 향하도록 노른자위의 더 깊은 부분 쪽으로 향하고 꼬리.</li>
		<li>배아 약 미디어를 제거 하는 장소에, tricaine 및 BDM, 0.7% LMP agarose의 ~ 200 µ L에 배아를 포함 하 고, 태아의 위치를 재조정 왼쪽 이나 오른쪽 필요에 따라 배아를 기울이기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LMP agarose 세트 (약 5 분 소요)까지 기다려 접시에 장착 매체를 추가 합니다. 배아는 이제 photoconverted 될 준비가. 참고:는 tricaine와는 BDM 사용 됩니다 anesthetize 배아와 태아의 심장, 각각 중지. 설치 미디어 영상, 전날 준비 될 수 있다 그러나 빛에서 미디어를 보호 하기 위해 확인 한다. 참고: 태아의 정확한 위치는 하나 photoconvert을 하고자 하는 셀에 대 한 명확한 레이저 경로 허용 해야 합니다. 레이저 광은 태아를 도달 하는 멀리 여행 하지 않아도 고 배아 수 쉽게 탑재 photoconversion 후 태아의 머리 우물의 시작 가까이 위치.</li>
</ol>4입니다. Photoconversion
<ol><li>직 립 confocal 현미경 (Leica SP8) 같은 장비는 405에 nm, 488 nm 및 561 nm 레이저 소스를 찾아 태아의 백색 광 (명시)와 목표 렌즈 전송 심장 사용 하 여 (같은 Leica HCX IRAPO L, 25 × 없음 0.95 목표). 빨간 데 형광 561 nm 레이저 (즉, 561 DPSS 레이저, ~ 5% 강도로, 검출기 589-728 nm에서 설정)를 사용 하 여 확인 합니다. 그런 다음, 488 nm 레이저 (즉, 30 mW 여러 줄 아르곤 레이저 ~ 5% 강도로, 검출기 502-556 nm에서 설정)를 사용 하 여는 endocardium 시각화.</li>
	<li>현미경 수집 소프트웨어에 "FRAP" 모드를 입력 합니다. 선택 ~ 1% 레이저 전원 모두 488 nm 및 561 nm 레이저.</li>
	<li>관심의 비행기에 초점을, 관심 (ROI)의 영역을 선택 하는 다음 25% 레이저 전력, 투자 수익을 통해 세 번 검사에서 405 nm 다이오드를 사용 하 여 photoconvert 셀 레이저. 부족 한 데는 투자 수익에서 photoconverted 해야, 스캔 405 nm 레이저 지역 세 번 다시. 모든 ROIs에 대해이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>소프트웨어에 "TCS SP8" 모드를 반환 하 고 인수는 561를 사용 하 여 z-스택, nm, 488 nm 레이저 순차적으로. 이미지 속도 높이기 위해 '양방향' 옵션을 선택 해야 합니다. 참고: 얼마나 오래 걸리는 photoconvert 및 이미지 각 배아 다릅니다. 심장 박동은 정상적인 심장 밸브 개발에 대 한 중요 한, 그래서 하지 않은 시간 photoconvert 모든 5 배아 의미 하는 경우에 30 분 이상 중단 마음을 유지 하지 마십시오으로 알려져 있다. 참고: photoconversion 과정, 사용 PMT 검출기, photoconversion, 후 그것 것이 좋습니다 '계산' 모드를 설정 하는 하이브리드 감지기를 사용 하 여. 이 때문에 하이브리드 감지기 더 민감합니다와 더 나은 품질의 이미지를 생산 할 수 있다 하지만 노출 과도 의해 쉽게 손상 됩니다.</li>
</ol>5. photoconverted 배아를 마운트 해제
<ol><li>Photoconversion, 후 유리 피 펫을 사용 하 여 약간 LMP agarose 휴식 후 부드럽게 빨 아 태아 태아의 머리 위에 눌러.<ol>
<li>PTU (를 포함 하는 중간은 BDM 씻어)와 배아 매체를 포함 하는 35 mm 페 트리 접시에 유리 피 펫에서 배아를 꺼냅니다.</li>
		<li>PTU와 배아 매체를 포함 하는 6-잘 접시에 잘에 배아를 전송. 이 단계는 배아의 메모를 계속 확인이 필수적인 나중 발달 단계에서 photoconverted 셀의 위치를 연결 하는 잘로 들어간다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이제는 배아 BDM 포함 매체에서 제거 됩니다, 그들의 마음 반환 배아 배아 정상적으로 개발을 계속 있도록 28.5 ° C에서 어둠 속에 약 5 분에서 다시 치고 시작 해야 한다.</li>
</ol>6. 배아 단계 나중에 photoconverted 세포 이미징
<ol><li>원하는 단계에서 마음을 중지 하 고 다시이 프로토콜의 3 단계 같은 배아 배아 배아를 추적 하려면 별도, 표시 된 요리에서 BDM으로 대우 되어야 하는 중요 한 차이점으로 포함 합니다.</li>
	<li>62까지 배아에 대 한 hpf, z-스택 endocardium 561를 사용 하 여의 획득 nm, 488 nm 빨강 및 녹색 형광을 위한 신호를, 각각. 62 보다 오래 된 단계에서 태아에 대 한 hpf, 다 사용 하 여 레이저 세트 940 nm 녹색가 488 nm 레이저 대신 이미지.</li>
</ol>7. 이미지 분석 배아 미만 48 hpf
참고:는 AVC의 조직 움직임 때문에 그것의 복잡 한 3 차원 구조 분석 하기 어려울 수 있습니다. 두 비 photoconverted 지역 또는 비 photoconverted 지역 두 photoconverted 지역 간의 AVC에의 길이 사이 AVC에서 photoconverted 영역의 길이 계량 수에 3 차원 구조를 지도 하는 2 차원 지도입니다. Photoconverted 배아의 이미지 48 전에 얻은 hpf는 다음 메서드를 사용 하 여 분석 될 수 있다.
<ol><li>Matlab 또는 유사한 소프트웨어에 인수 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>투자 수익, 즉 endocardium, 수동으로 delimitate 고이 지역 밖에 서 신호를 제거 하는 마스크를 적용 합니다.</li>
	<li>이미지는 endocardium에 포인트를 확인 하 고 3 차원에서 플롯를 강도 임계값을 적용 합니다. 안마당에는 소프트웨어에서 지우기 명령을 사용 하 여 심 실 관심의 포인트를 수동으로 지우기 여는 AVC의 좁은 하 고 가장 직선 부분에 해당 하는 포인트를 격리 합니다.</li>
	<li>그래서 얻은 AVC를 나타내는 포인트에 맞게 실린더를 사용 합니다.</li>
	<li>여러 샘플을 비교 하는 참조 시스템을 정의 합니다. 예를 들어 참조 시스템의 기원과 z 축으로 장착 되어 실린더의 축으로 AVC 포인트의 질량 중심을 채택 한다.<ol>
<li>긍정적인 z-위치 (심 실 또는 atrial) 심장의 같은 쪽에 항상 해당 하는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>X-y 평면에서 AVC 포인트 프로젝트 고 그들을 맞는 타원을 사용 합니다.</li>
		<li>타원의 주요 축과 레퍼런스 시스템의 y는 병렬 하 고 태아에 관하여 AVC의 내부 측면에 해당 하는 긍정적인 y-값 endocardial 포인트 z 축 주위를 회전 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세그먼트는 AVC, 3 차원 데이터 집합 반 비행기를 회전 하 여 얻은 몇 가지 평면 컷 {y = 0, x > 0} z-방향에서.<ol>
<li>이 비행기에 인접 픽셀의 농도 프로젝트 하 고 일관 된 방식에서 endothelium을 정의 합니다. 예를 들어 수동으로 선을 그립니다는 심에서 endothelium의 절반 두께에서 AVC의 심 실 쪽으로.</li>
		<li>보간 스플라인 도구 상자를 사용 하 여 표면으로 AVC를 대표 하는 3 차원 스플라인 endothelium을 대표 하는 라인의 포인트. 참고: 절단 평면 수 세그먼트화의 정확도이 단계 시간 소비를 모두 결정합니다. 일반적으로, 8 비행기 좋은 결과 달성 하기에 충분 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원통형 좌표를 사용 하 여 AVC 표면에 각 점의 방위 위치를 정의 합니다.<ol>
<li>각 방위 위치에 연속 점 사이의 표면에 아크 길이 계산 하 여는 AVC의 표면 따라 파라메트릭 커브를 정의 합니다.</li>
		<li>각 매개 변수 곡선 지점을 정의 합니다 0 AVC의 센터에 가장 가까운 곡선에. AVC의 포인트는 따라서 완전히 기술 그들의 방위 위치 및 그들의 위치에 의해 파라메트릭 커브에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포인트의 파라메트릭 위치를 사용 하 여 2 차원 이미지에는 AVC를 전개.</li>
	<li>바이너리 이미지 임계 처리의 모서리는 photoconverted 농도 비 photoconverted 채널 사이의 비율 척도를 영역의 가장자리를 찾아. 필요한 경우 수동으로 결과 수정.</li>
	<li>방위 위치의 기능으로 직물의 길이 계산 하기 위해 가장자리 사이의 아크 길이 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo:+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology.">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li><li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility.">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li><li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. 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A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion.">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li><li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins.">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li><li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion.">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhOTO+zebrafish:+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration.">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).</li><li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish.">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

Photoconversion의 타이밍: 비록가 남아 96 에서도 EdCs에 밝게 표현 hpf, 그 태아 성장 함에 따라 레이저 광 확산 더 장난의 한정 된 photoconversion를 더 어렵게 만드는 AVC에 도달 하기 전에 주목 해야 한다. At 배아 단계 55 보다 나중 hpf, 열기구는 심 실 및 아 트리 움의 의미 photoconversion 용 바이올렛 레이저 빔 AVC 셀 심 방 또는 심 실 첫 번째 통과 없이 연결할 수 없습니다. 55 이상 즉 hpf, photoconvert는 AVC?...

Zebrafish는 현재 셀룰러 및 발달 과정에 vivo에서공부 하는 가장 중요 한 척추 모델 중 하나입니다. 이것은 크게 zebrafish의 광학 투명도 그리고 유전학, 그것에 게 유전으로 관련 된 광학 기술을 적용 하기 위한 강력한 모델을 순종 인코딩된 photoresponsive 단백질 기술1. 특정 심장 개발의 연구, zebrafish 받을 충분 한 산소 보급을 통해 하트 비트 없이 돌연변이 분석을 허용 하는 발달 유전자 교란된 효과에 개발의 첫 번째 주까지 살아남을 수 있는 그런 심장 morphogenesis 대부분 척추 동물2가능 하지에 혈액 흐름.
Zebrafish 심장 관 24 시간 게시물 수정 (hpf)에 의해 형성 된다. 그것의 대형 조금 후에 심장 튜브 적극적으로 치고 시작 합니다. 36에 의해 hpf, 분명 수축 분리는 심 실에서 심. 수축의이 지역에서에서 호출 됩니다 것 운하 (AVC), 그리고이 지역의 변화에 셀 편평 형태학 cuboidal 형태3. Zebrafish 것 밸브 morphogenesis 시작 약 48 h 수정 게시. 5 일에 의해 게시물 수정, 두 개의 밸브 전단지는 AVC로 확장 하 고 심장 주기4안마당에는 심 실에서 혈액의 역류를 방지. AVC 및 밸브 형성 동안 셀 추적으로 심장의 빠른 박동 어려운 전통적인 시간 경과 현미경5,6을 통해 셀을 따라 도전적 이다. 말 외., 20167에서 적응이 프로토콜 Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질이 표시 됩니다를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 내 피 세포는 endocardium입니다. 약 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM)는 심장 박동, hpf, photoconverted EdCs 특정 발달 시간 점에서 고해상도 영상 36와 55 사이 EdCs의 정확한 photoconversion 수 있도록 일시적으로 중지 하는 데 사용 됩니다. 그것은 이전 보였다 EdCs photoconverted이이 메서드를 사용 하 여 photoconversion7시간 후에 5 일 이상 그들의 비전향된 이웃에서 구별할 수 유지 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoconverted EdCs 48 보다 어린 배아에서의 이미지 분석에 사용 되는 방법 내용을 hpf, 성공적으로 AVC 개발 (Boselli 외., 언론에서)9동안 조직의 움직임을 수행 하는 데 사용 되었습니다. 우리는 독자 것입니다 찾을 바랍니다이 프로토콜 유용한 AVC 및 밸브 개발 정상적인 배아, 그리고 돌연변이, morphants, 또는 약물 치료 배아 연구. Zebrafish 개발 하는 동안 photoconvertible 단백질을 사용 하 여 셀 추적에 관련 된 보다 일반적인 프로토콜 롬 바르도 외., 201210에 의해 문서를 참조 하십시오.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 &#215;, N.A. 0.95 objective)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (1-phenyl-2-thiourea)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Danieau</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 &#176;C&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g BDM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.7 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.78 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.47 g Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13477-34-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7.2 and store at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasCLEAR resin</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plus 39&#160;Freeform Pico 3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo

Embryogenesis, 동안 셀 셀 행동의 동적 변화를 받아야 하 고 개발 생물학의 분야에서 근본적인 목표는 이러한 변화 뒤에 세포 논리를 해독 합니다. Photoconvertible 단백질의 개발과 발견은 크게 주 었 이러한 동적 변화에 대 한 우리의 이해 광학 세포와 조직을 강조 하는 방법을 제공 하 여. 그러나, 동안 photoconversion, 시간 경과 현미경 및 후속 이미지 분석 뇌 또는 눈 등 장기 잠복 세포 역학에 매우 성공적인 것으로 입증 되었습니다,이 방법은 일반적으로 사용 하지 않습니다로 인해 개발에 심장 주기 동안 심장의 빠른 움직임으로 인 한 과제. 이 프로토콜은 두 부분으로 구성 됩니다. 첫 번째 부분에서는 photoconverting 및 이후 zebrafish 것 운하 (AVC)와 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀 (EdCs)를 추적 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 일시적으로 마음 자리를 정확 하 게 photoconversion에서 마약을 중지 포함 한다. 마음 다시 시작할 수 있습니다 약물 및 배아 개발의 제거에 따라 박동 EdCs 발달 시간 나중에 photoconverted의 고해상도 이미징 마음 다시 중지 될 때까지 정상적으로 계속. 프로토콜의 두 번째 부분에 2 차원 지도 3 차원 구조에서 형광 신호를 매핑하여 젊은 배아에서 AVC에서 photoconverted 또는 비 photoconverted 영역의 길이 계량 하는 이미지 분석 방법을 설명 합니다. . 함께, 프로토콜의 두 부분 기원 그리고 zebrafish AVC 및 것 심장 밸브, 구성 하 고 돌연변이, morphants, 또는으로 치료 배아 연구에 대 한 잠재적으로 적용할 수 있습니다. 있는 셀의 동작을 수 AVC 및 밸브 개발을 방해 하는 시 약

48에서 태아 photoconverted의 예로 hpf 80에서 다시 몇 군데와 hpf 영화 1 , 2, 그림 2에 표시 됩니다. 그들의 차동 색깔을 녹색 또는 그들의 빨간 양식으로 따라야 하는 셀의 동작을 사용 하면 형광등 빨간 형태, 그것의 형광 녹색 양식에서 단백질에서 변환 존중 레스터가 405 nm 빛에 노출 밸브 형성 동안 이웃입니다. 그것은 48 hpf AVC의...

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Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K 조회수.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. 이 프로토콜에가 생활의 endocardial 세포에서 형광 단백질의 photoconversion에 대 한 방법을 설명 합니다 zebrafish 태아 것 운하 및 것 심장 밸브 개발 하는 동안 endocardial 셀의 추적을 가능 하 게 .

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.