1차 배양에서 잔 세포 기능을 연구함으로써 안구 표면 건강의 성별에 따른 차이 뒤에 숨겨진 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리는 시스템에서 호르몬과 에스트로겐 물질을 제거함으로써 이미 확립된 결막 잔 세포 1차 배양 방법을 수정하여 성호르몬 수치를 보다 정밀하게 제어할 수 있도록 했습니다. 이 수정은 조사 결과의 정확성과 신뢰성을 향상시킵니다.
세포 내 칼슘 측정은 다양한 자극 하에서 잔 세포 기능과 각 자극에 의해 유발되는 세포 내 신호 전달 경로를 연구하는 방법입니다. 이 기술은 안구 알레르기, 안구 건조증 또는 결막염과 같은 안구 표면 질환에 대한 약물 개발로 확장될 수 있습니다. 이 기술은 특정 호르몬 수준의 밑에 잔 세포에 대한 각종 분자의 효력의 검열을 촉진합니다.
이 기술을 처음 접하는 사람들은 종종 결합 조직에서 결막 조직을 분리하는 데 어려움을 겪습니다. 우리의 조언은 조직의 질감과 재료 특성에 세심한 주의를 기울이는 것입니다. 결막은 탄력 있고 반투명해야 하며 결합 조직은 일반적으로 색상이 더 밝고 면 섬유와 비슷해야 합니다.
먼저 멸균 메스를 사용하여 인체 결막 조직을 1mm 입방체 조각으로 다집니다. 6웰 플레이트에서 각 웰에 1mm의 완전한 RPMI 배지가 들어 있는 4개의 조각을 파종합니다. 조각을 접시에 고정해야 합니다.
조직 조각을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 공기 95%에서 배양합니다. 이틀에 한 번씩 배양 배지를 새로 고칩니다. 파종 후 72 시간 후, 조직 플러그를 제거하고 잔 세포가 70-80 % 밀도에 도달 할 때까지 배양을 계속하십시오.
다음으로 PBS로 세포를 헹구고 0.05%트립신 EDTA를 추가하여 플레이트 바닥에서 세포를 분리합니다. 현미경으로 세포 분리를 관찰합니다. 그리고 세포가 분리되면 완전한 RPMI 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
셀 현탁액을 150G에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 페놀 적색이 없는 RPMI 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포 내 칼슘 농도 측정을 위해 세포 현탁액을 유리 바닥 배양 접시에 다시 파종합니다. Fura-2 AM 로딩의 경우 0.5%HEPES, 0.5%BSA 및 0.5마이크로몰 Fura-2 AM, 8마이크로몰 플루론산 F127 및 250마이크로몰 설핀피라존을 함유한 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액을 잔 세포가 포함된 유리 바닥 접시에 추가합니다.
세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 배양 후 250마이크로몰 설핀피라존을 함유한 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액으로 세포를 세척합니다. 세포 내 칼슘 농도 측정을 위해 Fura-2가 로드된 세포가 포함된 접시를 현미경 아래에 놓습니다.
그런 다음 200배 배율을 추가합니다. 20-50개의 셀이 포함된 대표 필드를 찾습니다. 프리핸드 기능을 사용하여 각 셀 주위에 윤곽선을 그려 배경 형광과 구별하고 소프트웨어가 측정값에서 배경 형광을 자동으로 뺄 때까지 기다립니다.
실험 시작 버튼을 클릭하고 8-15초 동안 기다렸다가 세포의 기준선 칼슘 수치를 확인합니다. 그런 다음 콜린성 작용제인 카르바콜을 조심스럽게 첨가하고 최소 120초 동안 또는 칼슘 수치가 기준선으로 돌아올 때까지 계속 측정합니다. 최대 세포 내 칼슘 농도의 변화를 사용하여 측정 첫 8초에서 15초 사이에 각 세포의 평균 기초 칼슘 수준을 계산합니다.
평균 기초 칼슘 수치가 500나노몰 이상인 세포를 데이터 세트에서 제거합니다. 다음으로 각 세포의 최대 세포 내 칼슘 농도를 계산합니다. 그런 다음 동일한 세포에 대해 측정된 최대 세포 내 농도에서 기초 칼슘 수준 값을 뺍니다.
마지막으로, 접시에 있는 모든 세포에 대한 최대 세포 내 칼슘 농도의 변화를 평균화합니다. 인간 결막 잔 세포의 순도는 잔 세포 마커, 사이토케라틴 및 나선 포마티아 렉틴 1에 특이적인 항체를 활용한 면역형광 염색을 통해 확인되었습니다. Fura-2 AM 분석 결과는 1% BSA가 있는 페놀 레드 프리 RPMI와 완전한 RPMI 배지에서 배양된 세포 간에 유의미한 차이가 없음을 보여주었습니다.
그러나, 카르바콜에 대한 세포내 칼슘 반응이 상당히 증가한 것은 진행된 RPMI 배지 그룹과 전체 RPMI 배지 그룹을 비교했을 때 관찰되었습니다. 가장 중요한 것은 충분한 세포 밀도의 1차 인간 잔 세포 배양을 얻는 것입니다. 성장하는 동안 조직 조각이 배양 플레이트에 달라붙어 효과적인 성장을 할 수 있는지 확인하십시오.
연구진은 자극 전에 다양한 억제제를 적용하거나, 수용체를 표적으로 삼거나, 세포에 분자를 신호화하여 특정 경로의 관여를 탐구할 수 있었습니다. 잔 세포 기능을 나타내는 다른 매개 변수, 뮤신 분비 및 미토겐 활성화 단백질 키나아제의 비활성화와 같은 경우에도 평가할 수 있습니다. 보완 측정은 다양한 자극에 대한 잔 세포의 반응에 대한 포괄적인 이해를 제공합니다.
