저자는 자금 (MCB-1157876) NSF 감사합니다. 우리는 또한 자신의 의견을 알베르토 Civetta의 존 Roote, 두 개의 익명의 감사합니다.

작은 규모의 실험은 전체 절차에 익숙하게하기 위해 수행해야한다. 1. 버진 여성과 나이브 남성 수집 , B) 오레곤-R 개인 순진 기준 남성을 수집하기 위해, C) w 1118 개인 처녀 암컷을 수집하기 위해 : 설명 실험의 간단한 버전은 성인의 다음과 같은 조합을 포함하는 초기 십자가의 네 가지 유형으로 구성 ) P {SW} 동형 남성과 처녀 여자 순진한 실험 남성 (유형 I)를 수집하기 위해 SDIC의 야생 형 조직을 운반 제어 라인에서, 그리고 D) P {SW} 동형 남성과 SDIC-SW-삭제 운반 SDIC-SW 결핍 (유형 II)를 수행 순진 실험 남성을 수집하기 위해 처녀 암컷. <ol><li> 8-10 여성과 5 명의 남성을 각각 포함하는 여러 개의 튜브를 설정합니다. 여성이 누워 허용계란 매 3-5 일 긴 새 튜브로 여행하는 성인, 어린이, 유아를 전송합니다. 병 아닌 병 필요한 경우 사용하고 항상 신선한 음식을 사용합니다. 필요한 튜브의 수는 연구 결과에 따라 실험 남성 유형의 번호와의 차이 (표 1)를 감지하는 데 필요한 것으로 추정 개인의 수에 따라 달라집니다. 유리 병 당 10 개 이상의 여성은 자손의 불임에 변화를 일으킬 수 있습니다 유생의 성장 동안 과잉 혼잡이 발생할 수 있습니다. 25 저장 작은 유리 병 ° 온도 제어 챔버에서 C. </li><li> 초기 십자가를 설치 한 후에 일에서 11 일, 12 일에 처녀 여성과 순진한 남성 수집을 시작. 대기 기간은 온도에 따라 다르며 낮은 온도 결과가 긴 개발 시간에 개인의 컬렉션을 지연. eclosion에 타이밍에 영향을 미치는 또 다른 요인은 매체의 유형입니다. 같은 옥수수 가루 효모 매체 29와 같은 영양 식품은 성인의 적절한 개발을 보장짝짓기를 용이 생식 시스템. 해제시 수집마다 4-6 시간을 비행. 수집 할 때, 병에 CO 2를 도입하여 파리를 마취, 파리를 아래로 누른 섹스 실체 현미경의 밑에 그들 (그림 2). 섹스와 적절히 표현형 및 라벨 유리 병에 다른 병에 원하는 파리를 놓습니다. </li></ol> 참고 1. 컬렉션 루틴은 폐기 전날 밤 동안 등장 성인에 의해 아침에 시작합니다. 하루 동안 한 번 또는 두 번 처녀 여성과 순진한 남성을 수집합니다. 일반적으로, D. 초파리의 수컷은 25 ° C 30 eclosion 후 성적 성숙 8 시간이됩니다. 파리는 12시 12분 시간 빛 / 어둠주기에 따라 유지되는 경우 eclosion 두 개의 피크가 예상된다 : 첫 번째 1-2 시간 동안 조명이 꺼지기 전에 빛이, 그리고 2 시간 동안 켜진 후. Eclosion는 번데기 어두워 후 24 시간 이내에 발생합니다. 참고 2. 10 개 이상 여성 SH하시는 분은 동 자료와 관련한는 오버 크롤 링을 방지하기 위해 동일한 병에 넣어. 적어도 그들 중 하나가 처녀가 아니기 때문에이 또한 그들이 폐기해야하는 경우 여성의 손실을 제한합니다. 3합니다. 짧은 시간 기간에 처녀 여성과 순진한 남성의 적절한 수를 수집하기 위해 다음과 같은 조치를 채택 할 수 있습니다. 실험적인 남성의 두 가지 유형 (표 1)을 포함하는 실험 1천1백18w 15-20 병을 설정합니다. 가볍게는 미디어의 표면을 뿌려 산란을 촉진하기 위해 몇 건조 활성 효모 알약을 추가합니다. 연속적인 일에 부모에게 적어도 4 번을 전송합니다. 부모가 다른 유리 병 (그림 3)로 전송 한 후 각각의 병에 번데기에 사용할 수있는 표면을 높이기 위해 4 일 또는 5 일 하루 동안 다 접힌 종이 (7 × 5 ㎝) 삽입합니다. 초기 십자가에서 등장하신 성인의 수는 충분하지 않다면, 며칠 만 더 기다려 개별적를 수집유리 병에서 루게릭 병은 다른 날짜로 설정합니다. 작업 부하를 고르게하기 위해 여러 연속 일 동안 실험을 수행 할 계획입니다. 2. 이중 교배 실험 그림 4는 14에서 수행 이중 교배 실험에 관련된 주요 단계를 보여줍니다. <ol><li> 1 일의 아침에, 첫 번째 짝짓기를 설정합니다. 오리건-R 남성은 범죄 분석에 짝을 가장 먼저입니다. <ol><li> 흡입기를 사용하여 10월 4일에서 5일까지 일 - 오래 된 흰색 눈 W 1118 처녀 여성과 10 빨간색 오레곤 R 순진한 남성 각을 포함하는 튜브를 설정합니다. 두 개의 유리 병은 연속 5 일 동안 매일 설정됩니다. 설정해야하는 병의 수는 사용 가능한 개인의 수에 따라 달라질 수 있습니다. 파리 2 시간 동안 짝짓기를 할 수 있습니다. </li><li> 오레곤-R 남성을 버리고 흡인기 (그림 5)를 사용하여 새로운 유리 병으로 각각의 여성을 배치합니다. 섹스 신분증 약간의 육안 검사에 의해 달성 될 수있다형태의 차이 (그림 2). 적절하게 각 유리 병에 라벨을 2 일 (이하 &quot;V1&quot;)를위한 유리 병에 여성을 둡니다. </li></ol></li><li> 3 일에, 두 번째 짝짓기를 설정합니다. 설정 남성과 십자가의 선택은 실험 남성 유형의 방향 잠재적 인 편견을 최소화하기 위해 무작위로 수행해야합니다. <ol><li> 표시등이 꺼져 있습니다 두 시간 전에, 흡인기와 새로운 유리 병에 다시 여성을 전송할 수 있습니다. 적절하게 새로운 병을 라벨 (이하 &quot;V2&quot;). </li><li> V2에 동일한 유전자형의 세 5-6 일 된 실험 남성을 소개합니다. </li><li> 각각의 여성에 대한 2.2.1와 2.2.2를 반복합니다. </li><li> 4 일, 오른쪽 빛 2 시간 전에는 흡입기를 사용하여 (즉, 2.2.1 이후 더 이상의 12 시간), 폐기 남성 켜져 있습니다. </li></ol></li><li> 6 일에, 또 다른 새로운 유리 병에 다시는 여자를 전송할 수 있습니다. 적절 (이하 &quot;V3&quot;) 새 튜브를 레이블을 지정합니다. </li><li> 10 일째에, W 1118을 폐기 </&gt; 암컷을 먹다. </li><li> v2 및 v3의 자손을 검사합니다. 여성은 V2에서는 여성 처음 시작 ovipositing 다음날 17 예 V2 (또는 V3)에 도입 된 후 첫 번째 검사는 13-15일 후에 수행됩니다. 두 번째 검사 총 17 일 후에 정확히 수행됩니다. 이 시간 프레임은 같은 병에는 2 세대 보장하지 않는 안전 위의 시간적 경계를 포즈. 자손 계산을 용이하게하면서 두 가지 검사는 과잉 밀집을 방지합니다. <ol><li> 주 17, V1을 검사하고 현재 빨간색 자손이 있는지 확인, 그에 따라 병을 표시하지 않을 경우. 어떤 자손이 참조 또는 실험 수컷 발생하지 않았와 그 짝짓기를 나타냅니다 동안 하얀 눈 자손의 존재는 여성 최초의 교배시에 처녀 없음을 나타냅니다. </li><li> 날 17 일에, V2의 첫 번째 검사를 수행합니다. 마취는 CO 2와 V2의 자손 등장과 눈 색깔과 성별을 정렬 할 수 있습니다. 첫 번째와 초만큼 아버지가 기록 자손 번호번째 남성. 그림 6은 각각의 짝짓기 방식의 자손의 예상 표현형을 보여줍니다. 이 특정 실험 14에서 유일한 여성 자손은 명확 참조 또는 실험 남성들이 희망하는 따라서 만 딸의 정보는 P 2를 계산하는 데 사용할 수있는 할당 할 수 있습니다. 다른 마커 남성 자손의 친자가 명확하게 할당 할 수있는 경우, 두 남녀의 자손 카운트 다운 스트림 계산에 사용할 수 있습니다. 자손을 무시하지만, 두 번째 검사 v2를 유지합니다. </li><li> 주 20, V2에서는 새로 등장 자손과 2.5.2에서와 같이 진행하고 병을 버린다. </li><li> 주 20에서 처음 v3의 등장 자손을 검사하고 단계 2.5.2를 따르십시오. </li><li> 주 23, V3에 새로 등장 자손과 2.5.3에서와 같이 진행합니다. </li></ol></li></ol> 주 1 : 다수의 짝짓기가있을 수있는 P 점수에 대한 잠재적 팽창 효과 (2.2.2 및 2.2.3) 때문에, 짝짓기특정 시간 프레임에 제한 될 수 있습니다. 시간 프레임은 암컷과 사용하는 남성의 유전자형과 관련된 remating 주파수에 따라 달라집니다. 여러 교배 확률은 특별히 야간 11시 감소된다. 주 2 :이 어른 파리의 수가 낮은 효모의 전면에 자라 난 가능성으로 인해 문제가 발생할 수 있기 때문에 살아있는 효모 알약을 추가하지 마십시오. 3. 데이터 분석 <ol><li> 기록 자손 계수는 적절한 통계 패키지 (SAS 연구소에서 예를 들어, JMP) 또는 무료 웹 기반 도구 (예를 들어 쉽게 육안 검사 및 효율적인 분석을 위해 적절하게 구성해야한다 <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> 정자 경쟁 능력. V2와 V3에서 카운트를 추가합니다. 없거나 매우 제한된 자손 (예를 들어, &lt;10)에 상승을 준 여성 파리는 절차 중에 사망 또는 만 성공적으로 insemina했다두 남성 중 한 테드가 아닌 정보로 간주되며 다운 스트림 통계 분석 (2.5.1 및 표 2)에서 제외됩니다. 각 정보 여성을위한 P 2 점수를 계산합니다. </li><li> 비교 실험 남성들 P 2 값이 통계적으로 유의 한 차이가 있는지 여부를 테스트합니다. 이 매개 변수 (예를 들어, Tukey의 HSD) 또는 P 2 값의 분포의 왜곡과 변화와 평균 사이의 의존성 등 여러 가지 요인에 따라 비 파라 메트릭 (예를 들면 강철 Dwass) 테스트를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 각도 변환은 일반적으로 파라 메트릭 테스트 (31)의 사용하기 전에 같은 P 2와 비율에 적용됩니다. </li><li> 상대 속도 차이 (옵션). 각 실험 남성 유형에 대해 이중 성관계 여성과 첫 번째 남자 (범죄 분석의 기준 남성과 D의 실험적인 남성과 성관계를하는 사람들의 수를 계산efense 분석). 양측 피셔의 정확한 테스트를 (에서 사용할 수를 사용 <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), 실험적인 남성의 두 가지 유형 사이에 통계적으로 유의 한 차이가 있는지 여부를 결정합니다. </li><li> 성비 (옵션). 각 실험 남성의 경우, 예상되는 1:1 비율의 각 여성 벗어나로부터 자손의 여부를 성별 비율을 결정하기 위해 카이 제곱 검정을 사용합니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 전적으로 별개의 상대적 기여도의 차이를 평가하는 실험 설계를 설명했습니다 D. 제어 이중 교배 실험 7,8의 자손에 melanogaster의 남성. 이 정자 경쟁 능력에 영향을 미칠와 유사한 절차는 방위 분석 (그림 1)에 적용되지만 그것이 범죄 분석에서 설명 된 가설 유전 적 요인의 맥락에서 수행되었습니다. 이 실험 설계는 이러한 여성의 유전자형 (32)의 ?...

제프 파커 곤충과 진화의 의미 2 정자 경쟁의 유행을 언급하기 때문에, 초파리와 다른 종의 연구 서지는 다양한 수준에서이 현상에 대한 몇 가지 빛을 발산하기 위해 노력했다. 관심 분야의 예는 자연 인구 9,10, 유전 구조와 유전 적 요인에게 11-14 기본의 관련성, 그리고 남녀 15,16 사이의 공진화를 몰고있는 그것의 역할의 변화의 조사되었다. D.에 초파리 여성, 전문 정자 저장 기관의 제한된 용량, spermatheca 및 정액 소켓 6,17의 쌍은 서로 다른 남성의 정자의 경쟁에 기여한다. 약 1,500 정자 언급 기관 18,19에서 수용 할 수있는 여성 만 ~ 500 짝짓기 중에 전송됩니다. 실험실, 제어 이중 교배 실험에서참고 남성과 관심의 하나 또는 그 이상의 남성과 관련된 사항은 광범위 정자 경쟁 능력 7,8을 평가하는 데 사용되었다. 정자 경쟁 능력은 총 자손에 이중 결합 실험에서 실험 남성들이 희망하는 자손의 비율로 추정, 즉 그 실험 기준 남성 모두에서.입니다 정자 경쟁 능력의 두 가지 구성 요소는 별도의 분석에서 평가 각각 구성되어 있습니다. 범죄 분석에서 첫 번째 남성의 정자를 치환하는 실험적인 남성의 정자의 능력은, 기준 남성 즉, 평가됩니다. 반대로, 국방 분석에서 실험 남성의 정자의 능력은 변위에 저항하거나 참조 남성 정자의 수정 성공을 줄이기 위해 평가됩니다. 분석, 방어 또는 공격의 유형에 따라 정액 경쟁 능력 점수 P 1, P 2, 각각을 통해 추정된다. 피1과 P 2 0과 1 사이의 값만을 취할 수 있습니다. 중간 값은 일반적으로 직접 정자 경쟁을 포함하는 생리 시나리오를 제안 정자 혼합의 간접적 인 증거로 해석됩니다. 같은 원리에 따라 극단적 인 값은 강력한 차등 정자 경쟁 능력에 대한 증거로 해석 될 수 있습니다. 초기 연구는 보여 주었다 D.에있는 P 2 초파리 7을 길게 두 교배 사이에 경과 된 시간으로 증가 0.8 이상이다. 이와 같은 실험 설계는 다른 초파리 종에서 사용되었습니다, P 2 정자 경쟁 능력 20을 평가하는 연구에서 일반적으로 사용되는 통계되고있다. 대부분의 종, 시험 균주의 P 2 값은 0.6 21보다 높다. 그럼에도 불구하고, 다른 남성의 정자 사이의 직접적인 경쟁 관계없는 여러 가지 다른 메커니즘은 동일 점수 (토론 참조) 얻을 수 있습니다. 디첫 번째 또는 두 번째 남성들이 희망하는 istinguishing 자손은 쉽게 식별 마커의 사용을 통해 가능하다. 초기 연구에서 남성의 하나의 치사량 복용에 조사 하였다 예를 들어, X-선은 방사선 조사 정자에 의해 수정 된 거의 모든 난자는 7 부화에 실패합니다. 그 후, 눈의 색소 침착이나 날개 모양을 변경 돌연변이는 가장 일반적으로 사용되는 마커했습니다. 전자의 예로는 돌연변이이다 BW (브라운) 9, CN (진사) 22 W (화이트) 23, 표현형의 두 번째 유형의 돌연변이 싸이 (곱슬) 24에 해당하면서, 이러한 돌연변이의 일부에 결합되어 동일한 개인, 예를 들어, CN BW. 낮은 정도, allozymes 25 알려진 상속 패턴 microsatellites 26,27도 사용되었습니다. 의 차이를 테스트하는 실험 설계정자 경쟁 능력은 클라크 등 본질적으로 여기에 다음을 설명했다. 9. 이 실험에서 파생 된 결과는 전적으로 감시 아래 실험 남성 유형의 차이 친자에 대한 정보를 제공합니다. 또한 피트니스 14,28 정자 시각화 기법 24의 사후 수정의 차이에 대한 오차를 분석은 P 1의 차이 (또는 P 2) 점수가 정자 능력의 차이로 해석 될 수 있습니다. 그림 1은 공격과 방어 분석 모두의 이론적 근거를 설명합니다. 프로세스의 물류를 설명하기 위해 범죄 실험 D.에 실시 초파리 14 자세히 설명한다. 이 특정 범죄 분석은 정자 경쟁 능력에 Multigene 사 가족 정자 특정 dynein 중간 체인 (SDIC)의 측정 효과를 테스트하는 데 사용되었다. 모든 회원이 Multigene 사 제품군의 s는 X 염색체에 나란히 존재합니다. 녹아웃 남성은 SDIC 클러스터를 삭제하여 생성 하였다. 삭제 된 세그먼트는 필수 유전자의 짧은 날개 (SW)를 포함하고 연구의 목적은 SDIC의 관련성을 평가하기 때문에, SDIC-SW 삭제를 들고 남성은 (P {SW}로 상징 SW의 유전자 사본에 의해 구출되었다 또한, 염색체 2 미니 화이트 리포터 유전자)를 수행하는. 눈 색깔은 친자 확인을위한 볼 마커로 사용되었다. 모든 파리는 참고 수컷으로 사용 된 균주 오레곤-R에서 이들의 예외 흰색 돌연변이 배경에 있었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

난자를 비옥을위한 conspecific 남성 간의 경쟁은 성적 선택의 메커니즘 중 하나, 오히려 극대화 생존과 생존 1보다 성공적인 짝짓기 이벤트의 수를 극대화 작동 즉, 선택이다. 정자 경쟁은 정자가 시간과 공간에서 우연되는 동일한 여성 2와 교미 후 수컷 사이의 경쟁을 나타냅니다. 이러한 현상은 식물과 동물 3 여러 종에서보고되었다. 예를 들어, 자연산 D. 초파리 암컷은 보통 2-3 남성 4에서 정자가 포함되어 있습니다. 정자는 다른 수컷 2.5에서 정자의 직접적인 경쟁으로 이어질 수있는 제한된 저장 용량을 가진 전문 기관에 저장됩니다. 관심의 다른 남성 (실험 남성 타입)의 정자 경쟁 능력을 비교하는 것은 통제 된 이중 결합 experimen을 통해 수행되었습니다실험실 6,7에서 TS. 간단히, 한 여성이 연속적으로 두 개의 서로 다른 수컷 한 실험 남자와 한 간 짝짓기 기준 남성에 노출됩니다. 같은 짝짓기 방식은 다음 따라서 일반적인 참조를 통해 자신의 정자의 경쟁 능력의 간접 비교를 용이하게 다른 실험 남성 유형을 사용하여옵니다. 실험 및 레퍼런스 남성에 의해 아버지가 개인의 비율은 한 간단한 수학적 표현하기 7,8을 사용하여 정자 경쟁 능력을 측정 할 수 있도록 마커를 사용하여 식별됩니다. 또한, 정자 경쟁 능력은 실험 남자가 서로 다른 역량의 특성을 반영 간주됩니다 메이트 (각각 공격과 방어 분석) 9, 두 번째 또는 첫 번째 여부에 따라 두 가지 시나리오에서 추정 할 수있다. 여기, 우리는 상상 속 t의 기초가 서로 다른 유전 적 요인의 역할을 심문하는 데 도움이 방법에 대해 설명합니다D. 정자 경쟁 능력의 그 현상 초파리.

표 2는 두 개의 범죄 실험의 일부 현저한 특징 (분석 실험 1과 2)를 요약하는 D. 와와 (각각 유형 I 및 II) 기능 SDIC 클러스터가없는 초파리 실험 남성은 14 비교됩니다. 계정에 일부 복제로 발생하는 다른 발생률을 복용 후, 여성의 58~83% 정보 및 따라서 그들의 자손의 친자 카운트가 P 2를 계산하는 데 사용 될 수있을 것으로 나타났다. 비 파라 메트릭 테...

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Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

사이에 차동 정자 경쟁 능력<em&gt; 초파리</em서로 다른 유전자형&gt; 남성은 이중 결합 실험을 통해 확인 될 수 있습니다. 이 실험의 각각은 관심과 기준 남성의 남성 중 하나를 포함합니다. 자손에서 쉽게 식별 마커는 각각의 남성에 의해 아버지가 개인의 분수 추론 할 수 있습니다.

정자 경쟁의 능력에 대한 평가의 차이<em&gt; 초파리</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K 조회수.  University of California, Irvine. 사이에 차동 정자 경쟁 능력 초파리 남성은 이중 결합 실험을 통해 확인 될 수 있습니다. 이 실험의 각각은 관심과 기준 남성의 남성 중 하나를 포함합니다. 자손에서 쉽게 식별 마커는 각각의 남성에 의해 아버지가 개인의 분수 추론 할 수 있습니다.

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Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

연구

생물학

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

매체-처리량에 캘리포니아2 +효과의 평가 대 한 분석 실험을 심사-신호 및 인간의 정자에서 Acrosome 반응

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Drosophila Pupal Notum 해부, 고정 및 시각화

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...