인공 막 공급은 이전에 수행되었지만 우리의 프로토콜은 설정이 더 간단하고 약간의 수정을 통해 다른 진드기 종에 적용 할 수 있습니다. 인공 막 공급의 주요 장점은 동물 사료를 통해 실현 가능하지 않을 수있는 병원체 및 치료법에 노출 될 수 있다는 것입니다. 이 인공 막 공급 시스템은 이상적인 식균 자극제에 대한 테스트와 이상적인 막 두께에 대한 수정을 통해 다른 절지 동물 종에 적용될 수 있습니다.
올바른 멤브레인 두께를 생산하려면 약간의 연습이 필요합니다. 마이크로 미터를 사용하여 멤브레인의 여러 위치에서 두께를 측정하십시오. 우리 연구실의 박사후 연구원인 Benjamin Cull이 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다.
시작하려면 70 % 에탄올로 팔 스탠드의 유리판 또는 세라믹 코팅 금속베이스와 같은 평평하고 비 다공성 표면을 닦은 다음 단일 플라스틱 랩으로 덮으십시오. 플라스틱 랩이 평평하고 기포나 주름이 없는지 확인하십시오. 준비된 표면에 100% 레이온 렌즈 청소지를 테이프로 붙입니다.
용지의 네 면 모두에 테이프로 평평하고 약간 팽팽한지 확인합니다. 0010 경도 실리콘 혼합물을 실리콘 키트의 각 부분 5 밀리리터를 측정하여 일회용 용기에 준비합니다. 두 액체를 가볍게 혼합하고 1.5 밀리리터의 헥산을 첨가하십시오.
혼합물이 균질하고 완전히 혼합 될 때까지 계속 혼합하십시오. 작은 스퀴지를 사용하여 실리콘 혼합물을 렌즈 용지 위에 분배하고 실리콘이 렌즈 용지에 스며들도록 1분 동안 그대로 두십시오. 꾸준히, 소량의 아래쪽 압력을 사용하여 스퀴지로 여분의 실리콘을 옆으로 긁어냅니다.
아래쪽 압력을 가하지 않고 스퀴지로 두 번째 패스를 수행하여 실리콘 라인을 제거하고 매끄러운 층을 생성합니다. 유충의 경우에만 공급 챔버의 상단을 Fluon 불소 중합체 수지에 여러 번 담그고 적용 사이에 건조시켜 일관된 층을 생성합니다. 밀폐된 화학 물질 또는 생물안전 캐비닛과 같은 먼지가 없는 환경에서 최소 24시간 동안 경화되도록 멤브레인을 그대로 두십시오.
다음으로, 실리콘 믹스 A와 B를 동일한 부분으로 혼합하여 챔버를 멤브레인에 부착하기 위해 30 경도 실리콘 혼합물을 준비합니다. 폴리카보네이트 챔버를 실리콘 혼합물에 약 1/4인치를 담근 다음 테이프가 겹치지 않도록 주의하면서 멤브레인 시트에 놓습니다. 부착 된 실리콘이 최소 24 시간 동안 경화되도록하십시오.
메스를 사용하여 부착 된 각 챔버 주변의 멤브레인을 조심스럽게 자르고 가장자리를 트리밍하여 측면을 많이 긁지 않고 6 웰 플레이트의 우물에 부드럽게 맞을 수 있도록합니다. 멤브레인의 추가를 최대화하기 위해 챔버 외부에 충분한 재료를 허용하십시오. 멤브레인 시트의 각 모서리와 중앙에서 남은 멤브레인의 작은 조각을 자릅니다.
각 조각에서 플라스틱 랩을 제거하고 마이크로 미터로 조각을 측정하여 평균 멤브레인 두께를 결정합니다. 챔버당 하나의 O-링과 함께 공급 챔버를 유리 비커에 넣고 섭씨 121도에서 최소 20분 동안 오토클레이브하여 살균합니다. 챔버를 사용하기 전에 식히십시오.
미리 준비된 오토클레이브 멤브레인 챔버를 꺼내고 그 주위에 O-링을 배치한 후 멤브레인을 덮을 만큼 충분한 70% 에탄올로 각 챔버를 채웁니다. 6웰 플레이트에 5분 동안 그대로 둔 다음 챔버와 멤브레인 사이 및 멤브레인 자체에 누출이 있는지 확인합니다. 챔버에서 에탄올을 비운 다음 생물 안전 캐비닛 또는 층류 후드 내부에서 자연 건조시킵니다.
혈액의 보체를 가열하고 활성화하려면 섭씨 56도에서 40 분 동안 가열하고 기계적으로 제세동 된 소 혈액에 포도당 리터당 2g을 보충하십시오. 멤브레인이 건조되면 약 20 마이크로 리터의 식균 자극제를 챔버 내부에 바르고 챔버를 기울여 표면 주위로 퍼뜨립니다. 식균 자극제가 건조하면 브러시 또는 집게로 진드기를 챔버에 빠르게 추가하십시오.
수조의 열로 인해 찢어질 수 있으므로 상단을 파라필름으로 밀봉하십시오. 그런 다음 우물 또는 챔버 당 5 밀리리터의 열과 활성화 된 혈액을 원추형 튜브에 넣고 섭씨 36 도로 설정된 수조에 넣으십시오. 혈액 5 밀리리터 당 3 밀리몰 ATP 5 마이크로 리터와 페니실린 스트렙토 마이신 곰팡이 존 50 마이크로 리터를 튜브에 추가하고 4.5 밀리리터의 혈액을 6 웰 플레이트의 우물로 옮깁니다.
챔버를 웰에 부드럽게 넣고 챔버의 O- 링 높이를 조정하여 멤브레인이 혈액에 앉지 만 측면 주변의 혈액 농도가 우물을 넘지 않도록합니다. 그런 다음 혈액과 막 사이에 기포가 형성되지 않도록 우물을 혈액에 비스듬히 놓습니다. 6웰 플레이트의 뚜껑을 공급실 위에 놓습니다.
챔버가 있는 6개의 웰 플레이트를 준비된 섭씨 34도의 수조와 뚜껑에 넣습니다. 웰당 5마이크로리터의 3밀리몰 ATP와 50마이크로리터의 100X 페니실린 스트렙토마이신 진균지대를 혈액 튜브에 추가하고 4.5밀리리터의 혈액을 새로운 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 수조에서 진드기 챔버가있는 6 개의 웰 플레이트를 꺼내고 우물에서 챔버를 제거합니다.
챔버와 멤브레인의 외부를 멸균된 1X PBS 10ml로 헹구어 혈액을 제거합니다. 오토클레이브 여과지를 사용하여 멤브레인과 챔버를 부드럽게 두드려 건조시켜 과도한 PBS를 제거합니다. 챔버 내부에 많은 응결이 있는 경우 새 파라필름으로 밀봉하기 전에 오토클레이브 여과지로 젖은 부분을 두드려 건조시킵니다.
그런 다음 챔버 상단의 파라 필름을 교체하십시오. 진드기 챔버를 신선한 혈액이 있는 새 6웰 플레이트에 넣고 필요한 경우 O-링 높이를 조정합니다. 플레이트의 각 챔버에 대해 이 단계를 반복합니다.
마지막으로 6웰 플레이트의 뚜껑을 챔버 상단에 놓고 새 6웰 플레이트를 섭씨 34도의 수조로 다시 옮깁니다. 부분적으로 충혈 된 ixodes 견갑골 님프가있는 진행중인 피드가 여기에 표시됩니다. 부착 부위 주변의 검은 색 또는 갈색 점은 식균 자극제를 만들기 위해 사료 공급 중 및 후에 수집 할 수있는 서리입니다.
부분적으로 충혈 된 ixodes 견갑골 님프가 막에 부착 된 것으로 보입니다. 충혈 된 유충 곰팡이의 껍질도 여기에서 볼 수 있습니다. 진드기 충혈 수와 계란 질량 무게가이 표에 나와 있습니다.
유충 및 님팔 충혈 실험 조건에는 이 기술에 사용된 보충제 외에 사슴 기관 균질액이 혈액에 첨가되었습니다. 여기서 성공적인 충혈은 다음 라이브 스테이지로 성공적으로 탈피 한 충혈 된 진드기 또는 성공적으로 알을 낳은 충혈 된 암컷으로 정의되었습니다. 렌즈 용지에 실리콘을 도포할 때 허용 가능한 두께를 얻으려면 연습이 필요하므로 사용하기 전에 멤브레인의 두께를 측정하는 것이 항상 중요합니다.
막 공급은 진드기를 병원균이나 항생제에 노출시킬 수 있습니다. 탈피 성공, 알을 낳고 생존과 같은 진드기 생물학의 측면에 미치는 영향은 사료 공급 후 평가할 수 있습니다.
