가이 작품에 공헌한 많은 사람들이 있고 대부분은 구조와 기능 생물 그룹 팀장 막 과거와 현재 멤버 모두 출신. 모든 우리는 우리의 따뜻한 감사와 감사를 확장합니다. 이 작품은 과학 재단 아일랜드 (07/IN.1/B1836), 건강 (GM75915)의 국립 연구소, 그리고 리머릭 대학에서 부여에 의해 일부 지원되었다.

구조 및 기능 생물학 분야에서 중요한 초점은 생물 학적 막 (그림 1)입니다. 셀을 클릭하고 하위 세포 organelles 현재 주변 막이, 두 개만 지질 분자를 통해 molecularly 얇은 구조이며, 단백질과 함께 박혀있다. 로 지질과 단백질을 모두 적용 구조와 기능은 관심이 있습니다. 그러나,이 문서의 초점은 막 단백질로 제한됩니다. 막 단백질은 분자 수준에서 작동하는 방법의 더 나은 이해는 두 가지 이유에 대해 모색하고 있습니다. 첫째, 그들이 일하는 방법을 아는의 지적 만족이 있습니다. 둘째, 단백질이 어떻게 작동하는지 아는가, 그것이 특정 응용 프로그램을 위해 수정도 고장 그것해야하거나 개선이나 고칠 수있는 전망은 항상있다. 약물 설계 작품의 이러한 종류의 명백한 결과입니다. 막 단백질은 분자 수준에서 어떻게 작동하는지 냈지 한 접근 방식의 구조를 결정하는 것입니다. 이것은 단백질을 구성하는 모든 원자의 3 차원 공간에서 위치, 또는 적어도 아닌 모든 수소 원자를 확립 포함됩니다. 우리가이 목적을 위해 사용하는 방법은 macromolecular X - 선 crystallography (MX)입니다. 그림 2는 구조 MX를 사용하여 결정되었다 막 단백질의 예를 보여줍니다. 단백질의 회절 품질 결정이 MX를해야합니다. 분명, macromolecular의 crystallography를 사용하여 구조 결정에 관련된 많은 단계가 있습니다. 이것은 그림 3에서 그림입니다. 일반적으로, 이들은 막 단백질 대상을 식별하는 포함하고, 생산 정화하고 crystallizing. 회절 측정은 가정이나 싱크로 트론 X - 선 소스를 사용하여 결정에 수행됩니다. 회절 데이터는 분자 모델을 장착하는 전자 밀도지도를 항복 처리됩니다. 모델은 세련된 때, 단백질의 행동의 메커니즘을 탐구하는 데 사용과 구조 기반 약물 설계. 수 있습니다 이 문서의 초점은 우리가 meso 방식의 이른바하여 lipidic mesophases를 사용하여 막 단백질의 회절 품질 결정 생산 방법을 보여줍니다. 방법과 범위의 최근 검토 참조 1 (여보세요, 2009)에서 사용할 수 있습니다. 우리가 따를 단계별 프로토콜 참조 2 (팀장과 Cherezov 2009)에 설명되어 있습니다. meso 막 단백질 결정화 재판에서 설정에 필요한 시간과 관련된 단계를 요약 흐름도는 그림 4에 표시됩니다. 이 문서는 점선 붉은 선으로 둘러싸인 그 단계를 다루고 있습니다. 1 부 : 결정화 접시를 준비 <ol><li> 작업 벤치에서 silanized 현미경 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 다공 더블 스틱 스페이서 테이프의 스트립 (상용, 특정 시약 및 장비 아래 표 참조) 중 하나 표면에서 보호 종이 커버를 제거합니다. </li><li> 슬라이드의 표면과 접촉, 아래 테이프, 스티커 옆에 놓습니다. </li><li> 압력 인감 브레 이어 또는 롤러를 사용하여 슬라이드에 테이프를. 알루미늄 호일은 테이프와 우물의 기지를 보호하기 위해 롤러 사이에 삽입할 수 있습니다. </li><li> 그 상위 끈적끈적한 표면을 노출하는 테이프에서 두 번째 종이 커버를 제거합니다. </li><li> 빨리 로딩으로 우물의 신속하고 효율적인 씰링을위한 플레이트와 근접 거리에 플레이스 개별 silanized coverslips이 완료되었습니다. </li></ol> 2 부 : 준비 지질 주사기 <ol><li> 3 분 ° C 그것이 용융 렌더링 45에서 온도 제어 블록에있는 지질 (자주 monoolein)를 놓으십시오. </li><li> 지방질이 녹아있는 동안 지질 단백질 혼합 단계에서 사용하는 두 100 μL 가스 기밀 해밀턴 주사기를 준비합니다. 단백질 솔루션을 포함합니다 주사기에서 테플론 물미를 제거합니다. (장소에의 물미를 떠나) 그 옆에있는 지질을 개최합니다 주사기를 놓습니다. </li><li> 지질 주사기로 (특정 시약 및 장비 아래와 레퍼런스 3 (쳉 외 표를 참조하십시오., 1998)) 커플러를 연결합니다. 주사기에 커플러를 손가락 - 조여하지만 오버 조여하지 않습니다. 지질 주사기의 총신에서 플런저를 제거합니다. </li><li> 지방질이 계속 진행하기 전에 용융 있어야합니다. 30 μL에 피펫을 설정 천천히 녹은 지방질의 약 30 μL를 가져가라. 천천히 당신이 수있는 공기 격차를 소개하지 돌보는 주사기의 열린 끝에 녹은 지방질의 많은를 제공합니다. </li><li> 녹은 지방질과 접촉 배럴로 플런저를 놓고 천천히 수직으로 비디오에서 보여준 개최 주사기와 총신 최대 플런저를 전진. 실수로 갇혀있을 수 있습니다 공기 방울이 과정에서 상승해야하고 발표합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기 배럴에 표시를 읽는하여 주사기 안에 지방질의 볼륨을 결정합니다. </li><li> 해주실 슬라이드커플러에서 연장 바늘에 ule. 총신 일어나서 천천히 그리고 부드럽게 커플러의 핵심에있는 바늘에 녹은 지방질을 강제로 플런저를 사용합니다. </li></ol> 파트 3 : 준비 단백질 주사기 <ol><li> 단백질 솔루션은 4 5~10분에 대한 1만4천g에 소용되어야 ° C는 결정화 실험을 설정하기 전에 큰 집계를 제거하십시오. 얼음에서 단백질 용액을 제거하고 실온에서 평형 수 있습니다. </li><li> 에서 입방 단계를 폼 또는 전체 수화 가까이하는 데 사용할 단백질 솔루션의 볼륨을 계산합니다. monoolein 들어 20 ° C, 물을 가득 수화는 위상 그림 5 (그림 5)에 가까운 40 %의 물 (질량에 의해)에 발생합니다. </li><li> 25 또는 50 μL 해밀턴 주사기와 함께 단백질 솔루션의 필요한 볼륨을 차지. 공기 방울을 피하기 위해 돌보는 단백질 주사기의 총신에있는 플런저의 테플론 팁에 솔루션을 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 바늘을 철회하고 주사기에 단백질 용액의 볼륨을 측정합니다. 그것은 이전 단계에서 전달되는 값과 일치해야합니다. </li><li> 천천히 오픈 엔드와 플러시를 종료하기 위해 총신 최대 단백질 솔루션을 인치. </li><li> 지질 주사기에 연결된 커플러의 오픈 엔드에 단백질 주사기 보자. 이것은 장치가 과도하게 강화되지 않을 것이 중요합니다. 이상 - 강화 단계에서 조립 혼합 장치하면 ferrules에 손상을 누출하게됩니다. 아래 - 강화는 또한 누수로 이어질 것입니다. </li></ol> 4 부 : 혼합 단백질 솔루션 및 지질 : Mesophase 만들기 <ol><li> 혼합 효과, 커플러 통해 지질 주사기로, 단백질 주사기의 단백질 솔루션을 구동 엄지손가락이나 검지 손가락으로 한계에 조립 혼합 장치의 단백질 측면에 플런저를 전진. </li><li> 지질 측면에 플런저 이제 커플러 통해 단백질 주사기로 다시 지질 주사기의 내용을 운전하는 데 사용됩니다. </li><li> 과정은 여러 번 반복되며 때로는 수백 구절 이상 동질 mesophase를 생성해야합니다. 혼합, 커플러를 통해 앞뒤로 물질의 운동 시간에, 고르지 될 수 있고의 시작, 여분의 힘이 혼합 효과에 필요합니다. 초기 혼합은 보통 샘플의 비 균일한 흐려의 개발과 함께합니다. 균질이 진행되는 동안 새로운 입방 mesophase의 시각적 외관이와 마찬가지로, 질감, 더 균일하고 점성 입방 단계의 특성이된다. </li><li> 조건이 적절하고 입방 위상 양식하는 경우, 분산은 주사기의 총구에 광학 투명하게 나타납니다. 따라서 주사기 배럴에 표시가 총신에 mesophase을 통해 명확하게 판독해야합니다. </li><li> 얼음 짧은 시간 동안 주사기 믹서를 배치하여 혼합하는 동안 시료의 아주 약간의 냉각 균질화 및 투명성의 달성을 가속하실 수 있습니다. 그러나, 그것은 샘플을 overcool하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 이 샘플 온도 마찰 가열 3으로 인해 상승시킬 수 있으므로주의가, 혼합 매우 활발한 않도록 주의해야한다. </li></ol> 5 부 : 디스펜서 로딩 <ol><li> 10 μL 해밀턴 주사기에서 바늘과 플런저를 제거합니다. 장소에 테플론 물미를 남겨주세요. </li><li> 작은 동전의 도움으로 발급기에서 유지 너트를 제거합니다. </li><li> 래칫 팔을 완전히 철회로 주사기를 삽입 -의 플런저 및 바늘없이 - 발급기의 개최 링을 통해. </li><li> 유지 너트, 주사기를 마주 개스킷 측면을 교체하고 주사기의 열린 끝에 단단히 그것을에 나사. 치료는 주사기가 제대로 개최 링과 총신이 래칫 팔에 평행하게 정렬되어 중심 않도록 주의해야한다. 모두 눈으로 판단하실 수 있습니다. 이 두 요구 사항은 누설을 피하기 위해 중요하다. </li><li> 그리 퍼 너트 몇 차례 unscrewed와 재밌 링을 통해 플런저을 통과하고, 주사기의 열린 끝을로 플런저를 안내입니다. 완전히 래칫 팔을 놓으면 되죠. 배럴로 플런저를 이동하고 총구에 자유롭게 진정한 여행 있는지 확인하십시오. 그것은 자유롭게 이동 플런저를 촉진하기 위해 가이드 표시줄에있는 나사를 느슨하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것 않는다는 것을 확인하십시오. 는 테플론 팁은 총신의 제로 μL 졸업 마크 일치 때까지 플런저를 우울하게. 가이드 바에있는 나사가 느슨하게 경우, 그것을 retighten와 플런저가 자유롭게 움직이는 것을 다시 확인해. </li><li> 다른 주사기 및 커플러에 mesophase을 전송 제로 μL 졸업 표시 조립 혼합 장치의 한쪽에있는 플런저를 이동합니다. </li><li> 혼합 장치의 빈 주사기를 (장소에서의 물미)를 분리하고 즉시 로드된 주사기를 연결 - 커플러와 함께ttached - 10 μL 분배 주사기의 스레드 종료. 커플링이 완료되는 죄어져 있음의 정도는 이미 언급, 중요합니다. </li><li> 그래서 100 μL 주사기의 플런저를 우울하여 분배 주사기를로드 커플러를 통해 전송 mesophase. </li><li> 분배 주사기의 철강 종료 짧은 평면 스쳐 바늘을 안전하고 조심스럽게 자리에 조여. </li><li> 재밌 반지의 너트를 조이고하여 래칫 팔로 플런저를 클램프. 관리이가 사용할 수 없게 렌더링 플런저를 점수와 변형 수 있듯이, 너트를 통해 - 강화하지 않도록해야합니다. 고정되어 상태에있는 래칫 팔 제공된 여행 범위로 비디오 시연 인치보다 더 이상으로 제한하는 것이 중요합니다. 이 외에도, 플런저는 버클과 배달 실패 수있는 경향이 있습니다. </li><li> 따라서 바늘의 무효 볼륨을 작성하고 바늘을 로딩, 총신의 플런저를 사전에 래칫 드럼 여러 번 놓으면 되죠. 이 단계는 mesophase의 연속 문자열이 바늘 끝에서 나온다 때까지 (최대 10 회) 반복해야합니다. </li><li> 어떤 단백질은 추가 침전제없이 입방 단계에 불안과 같은 결정화 실험은 즉시 시작한다. </li></ol> 6 부 : 결정화 번호판을 설정 <ol><li> 표면에 다중 잘 결정 플레이트와 coverslip가 로딩의 용이성을 위해 작업 벤치 위에 몇 인치를 제기 플레이스. 표면이 약간 어두울 때 최적의 콘트라스트 및 향상된 가시성을 실현하고 있습니다. </li><li> 침전제 솔루션을 균질하고 튜브를 모자를 벗다. 1 μL로 침전제 분배 pipet을 설정합니다. </li><li> 한 손으로 수직 개최 분배 주사기로 중앙에 직접 잘 넘버 1의 기본 위에 바늘 팁을 위치로 자유롭게 손을 사용합니다. 유리 표면에 mesophase의 볼러스을 추방하기 위해 반복 발급기에서 버튼을 누릅니다. 표준 반복 발급기는 10 μL 주사기와 함께 사용하는 경우 볼러스 볼륨 200 NL 있습니다. 바늘의 끝이 제대로 전달을 위해 우물의 바닥 위에 수백 micrometers보다 더 이상이어야합니다. </li><li> 4 인접 우물은 mesophase, 장소 2 μL pipet 및 표준 일회용 도움말을 사용하여 각 mesophase의 볼러스 위에 침전제 솔루션 1 μL와 함께 로드된 후. </li><li> 가능한 한 빨리으로 균일하게 그들을 커버하기 위해 가득 우물을 통해 정면 coverslip을 넣으십시오. 물이 단단히 밀봉 영향을하려면, 그것은 스페이서 테이프의 끈적끈적한 표면에 노출된 접촉하게 coverslip에 압력을 적용하기 위해 주걱을 사용합니다. </li><li> 접시에있는 모든 우물이로드와 봉인된 때까지 mesophase 및 침전제 분배 과정은 반복 수 있습니다. </li><li> 추적을 위해 명확하게 번호판을 레이블. 라이트에 민감한 단백질은 일반적으로 배양 챔버에서 그들을 배치하기 전에 알루미늄 호일에있는 접시를 포장하여 처리됩니다. </li><li> 보통 20, 온도 제어 챔버에서 접시를 놓습니다 ° C. </li><li> 정기적인 일정에 따라, 20 배 10 목적으로 편광 현미경을 사용하여 결정 성장을위한 우물을 검사합니다. 다음과 같이 저자의 연구실에서 사용하는 일정은 다음과 같습니다 : 일 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 및 60 사후 설치. 조심스럽게 0.14 - mm 두께 샘플 내에서 초점의 깊이를 조정 mesophase의 볼러스을 검사합니다. 시험은 일반 조명과 교차 - polarizers 사이에 모두 완료해야합니다. </li></ol> 7 부 : 대표 결과 결과 결정의 모양은 막 단백질의 고유 색상에 따라 달라질 것이며, 빛의 편광은 검사 (또는 부족)와 조명의 방식과 품질에 사용. 그림 6은 몇 가지 결정 모습을 보여줍니다. 일반 조명과 함께 볼 때 meso의 성장을 자연스럽게 컬러 막 단백질은 그림 6 (패널 B와 D)에 표시된 것과 같은 찾을 수 있습니다. 정상적인 빛으로 볼 때 입방 단계에서 성장을 무색 막 단백질 결정은 그림 6 (패널 E)에 표시된 것과 같은 찾을 수 있습니다. 마지막으로, 편광과 함께 볼 때 meso의 성장 무색 막 단백질 결정은 그림 6 (패널 A와 C)과 같은 찾을 수 있습니다. 구조 결정의 전반적인 프로세스의 다음 단계는 수확 및 cryo - 멋진 결정을하고 그들로부터 X - 선 회절을 기록하고 분석할 수 있습니다. 이러한 주제는 별도의 조브 기사에서 다루지 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1.와있는 지질 이중층을 보여주는 생물 학적 막의 도식 표현은 단백질의 다양한 위치하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 구조비타민 B 12 수송 단백질, BtuB의 MX이 조브 문서에 그림 meso 방법 6으로 성장 크리스탈을 사용하여 해결. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 구조 기능주기 얻기 및 단백질에 대한 전체 구조 정보를 이용에 관련된 단계의 많은을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 순서는 meso 방식에 의한 막 단백질 결정의 생산에 관련된 단계를 요약한 것입니다. 빨간색 선은 점선으로 둘러싸인만이 이러한 단계는이 조브 문서에 나와 있습니다. 참고 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 지질 (monoolein) / 물 시스템을위한 단순 온도 작곡 위상 다이어그램. 결정화 실험은 20까지 설정되어 있습니다 ° C 지질이 40 % 수화에서 물을 어디 saturates. 자세한 위상 다이어그램 참조 5 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. lipidic mesophase의 성장을 막 단백질의 결정. (A) 비타민 B 12 수송 단백질, BtuB 6 모나스에서 (B) II 7 단지 빛을 수확, (C) adhesin / invasin OpcA 8 (D) bacteriorhodopsin 9, (E) 탄수화물 전송. 이미지는 정상적인 빛 (B, D, E)과 교차 polarizers (A, C) 사이의 기록.

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	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

입방 단계는 변수의 숫자의 변화와 함께 크게 변경할 수있는 섬세하고 역동적인 환경입니다. 그것은 모든 잠재적인 함정을 설명하는 매뉴얼 모드에서 meso의 결정화 실험에의 설치에 대한 설명을 제공하는 것은 불가능합니다. 그러나, 많은 어려움이 비싼 단백질 솔루션에 적용하기 전에 기술을 연습하여 및 믹싱 동안 주사기에 적용된 압력 검토 기능을 사용하여 피할 수 있습니다. 제대로, meso 방법에있는이 단백질의 다양한 결정을 얻을 수의 수가 지속적으로 증가하고있다. meso의 결정화 실험에서의 설정을 여기에 주어진 설명은 수동 모드에 중점을두고 있습니다. 프로세스 수 있으며, 자주 결정화 조건의 대규모 검사를 필요로 이러한 경우에 결정화 접시의 자동 설치를 용이하게하도록 수정됩니다.

가공 자신의 내로우 보어 커플러를위한 * 자세한 사항은 참고 자료 3 제공됩니다.

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

lipidic mesophases를 사용하여 막 단백질을 crystallizing에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러가지 lipidic 입방 단계 또는 meso 방법에 규정된되었습니다. 메소드가 prokaryotic와 진핵세포 단백질의 X - 레이 crystallographic 구조, monomeric, 호모 및 이종 multimeric, 발색단 함유하고 발색단 - 무료 단백질을 해결하는 데 사용되었다는에서 매우 다재 다능한 것으로 표시하고, 알파되었습니다 - 나선형 및 베타 배럴 단백질. meso의 결정에 사용하는 최근의 성공은 인간 공학 beta2 - 아드레날린과 아데노신 A2a G 단백질 결합 수용체 있습니다. 프로토콜은 monoolein 기반 mesophase에 막 단백질을 reconstituting, 그리고 매뉴얼 모드에서 crystallizations을 설정 제공됩니다. 이러한 결정 수확 등 전반적인 과정에서 추가적인 단계, 미래의 비디오 기사에 해결 될 수 있습니다. 시간이 단백질 로드된의 mesophase를 준비하고 결정 플레이트를 설정하는 데 필요한 수동으로 약 1 시간입니다.

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Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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Research

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Biology

29.8K 조회수.  Trinity College Dublin. 본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

비디오: Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

연구

생물학

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Macromolecular의 결정학에 의해 구조 결정에 대한 Lipidic Mesophases에서 재배 막 단백질의 수확 및 Cryo 냉각 크리스털

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebrafish 개발하는 동안 Photoconvertible 단백질을 사용하여 셀 추적

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

높은 처리량 SHAPE를 사용하여 RNA 이차 구조 예측

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...