곰팡이 베타글루칸은 면역 체계의 중요한 조절제입니다. 순도 및 분리 프로토콜을 강화하는 것은 암 치료를 위한 공동 보조제로서의 잠재적인 역할을 주장하는 데 필수적입니다. 분자 생물학 및 단백질체 실험실에서 흔히 볼 수 있는 다양한 장치를 사용하여 4가지 다른 베타글루칸의 높은 수준을 달성했습니다.
이 프로토콜은 뇌에서 가장 풍부한 상주 면역 세포인 미세아교세포에 대한 베타글루칸의 효과를 테스트하는 데 중점을 둡니다. 교모세포종에서 미세아교세포 표현형을 조절하는 것은 에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있다. Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus 및 Ganoderma lucidum의 신선한 자실체를 증류수로 5 번 헹구어 가용성 버섯 다당류 또는 SMP의 추출을 시작합니다.
그런 다음 세척 된 자실체를 기존의 공기 건조 오븐에서 섭씨 50도에서 약 24 시간 동안 완전히 건조시킨 후 블레이드 밀에서 분쇄하여 각 버섯에서 약 200g의 분말을 얻습니다. 다음으로, 1, 000 밀리리터의 증류수에 4 개의 버섯 분말 또는 MP 100 그램을 현탁시키고 섭씨 121도에서 15 분 동안 현탁액을 오토 클레이브한다. 실온에서 30 분 동안 배양 한 후, 생성 된 현탁액을 섭씨 4도에서 10 분 동안 6, 000 G에서 원심 분리한다.
그런 다음 불용성 버섯 다당류 또는 IMP를 함유한 침전물을 공기 건조 오븐에서 섭씨 50도에서 24시간 동안 건조시킵니다. 침전물을 버리고 상층액을 회전 증발기에서 10회 농축한다. 다음으로, SMP를 함유 한 농축액을 섭씨 4도에서 밤새 에탄올로 침전시킨다.
에탄올 현탁액을 섭씨 4도에서 15 분 동안 6, 000 G에서 원심 분리 한 후, 피펫으로 상층액을 버리고 펠렛을 80 % 에탄올로 3 회 세척 한 후 용해시키고 증류수로 세척한다. pH를 6.5 내지 7로 조정하고 온도를 섭씨 37도로 조절하고 현탁액을 각각 2 단위 및 4 단위의 알파-아밀라아제 및 글루코아밀라아제로 처리하여 알파-글루칸을 가용화시킨다. 다음으로, pH를 8.0으로 조정하고 온도를 섭씨 50도로 조정하고 현탁액을 단백질 그램당 2.5 단위에 해당하는 알칼라제로 처리하여 단백질을 가용화시킨다.
가수분해 후, 가수분해물을 원심분리하고 상등액 농축액을 회전 증발기에서 5회 세척한다. 80% 에탄올을 첨가하여 상등액 농축액을 다시 침전시킨다. 저분자량 분자를 제거하기 위해, 침전물을 증류수에 가용화시키고, 12, 000 달톤 컷오프 셀룰로스 튜브 멤브레인을 사용하여 24시간 동안 증류수에서 투석한다.
수용성 부분을 회수하고 동결 건조하여 가용성 베타글루칸 또는 S 베타-G를 생성합니다. 총 글루칸과 알파 글루칸을 별도로 평가합니다. 결과 베타-글루칸 값을 총 글루칸 값과 알파-글루칸 값의 차이로 측정합니다.
UV 가시광선 분광광도계를 사용하여 S beta-G UV 스펙트럼을 얻기 위해, 증류수 중 각 S beta-G의 밀리리터당 1.0 밀리그램을 제조하였다. 샘플을 석영 큐벳으로 옮기고 실온에서 200-400 나노미터 영역에서 스캔합니다. UV 가시광선 검출기 및 SuperdexTM 200 10/300 GL 겔 여과 컬럼이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC를 통해 S beta-Gs 및 폴리머의 분자량의 균질성을 추정합니다.
샘플의 적외선 스펙트럼을 푸리에 변환 적외선 또는 FTIR 분광계에 4, 000 내지 500 센티미터 범위로 기록한다. P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum 및 H.erinaceus에서 분리된 4가지 다른 베타글루칸의 밀리리터당 0.2밀리그램 농도로 BV2 미세아교세포 세포를 72시간 동안 코팅하여 미세아교세포를 활성화합니다. 72 시간 후, 피펫으로 상청액을 수집하고 나머지 부피를 0.20 마이크로 미터 주사기 필터를 통과시킵니다.
그런 다음 상청액을 섭씨 영하 80도에서 최소 24시간 동안 동결합니다. GL 261을 사전 활성화된 미세아교세포 조절 배지로 처리하려면 250마이크로리터의 베타글루칸 처리된 소교세포 배지를 80% 융합성 GL 261 세포에 72시간 동안 추가합니다. 72시간 후에 배지를 폐기하십시오.
상이한 S beta-Gs의 UV 스펙트럼은 260 및 280 나노미터에서 UV 흡수 피크를 나타내지 않았으며, 이는 S beta-Gs가 핵산 및 단백질이 결여되어 있음을 나타낸다. HPLC 크로마토그램은 P.ostreatus의 경우 10.9분, lucidum의 경우 10.5분, P.djamor의 경우 11.3분, H.erinaceus의 경우 8.20분에서 주요 날카롭고 단일 피크로 우수한 균질성을 보였으며, 이는 분획이 단일 중합체와 일치함을 시사합니다. FTIR 스펙트럼은 공유 다당류 결합에 해당하는 분자 진동을 측정했습니다.
SS beta-Gs는 최소한의 단백질과 결합 된 탄수화물로 구성되어 있음을 보여주었습니다. S 베타-G의 단당류 프로파일을 분석한 HPTLC 및 GC-MS는 다량의 D-포도당, 소량의 D-갈락토오스 및 D-만노스, D-자일로스, D-람노스, D-푸코오스 및 L-아라비노스의 미량의 존재를 밝혀냈습니다. ImageJ 소프트웨어의 사내 스크립트를 사용하여 각 형광 채널에 대한 포지티브 픽셀 수를 정량화했습니다.
스크립트는 각 형광단의 강도에 대한 임계값으로 제어 샘플을 사용하고 픽셀 수를 제공했습니다. 상이한 실험 조건 후에 각 마커에 대한 발현을 나타내었다. 흥미롭게도, GL 261은 상이한 미세아교세포 조절 배지에 노출되었을 때 종양 증식과 관련하여 유의한 차이를 겪지 않았다.
그러나, P.djamor와 H.erinaceus는 절단된 카스파제-3에서 각각 약 6배 및 9배 증가의 강력한 유도를 보였다. 베타글루칸의 고급 순도를 보장하는 것은 이 프로토콜에 필수적입니다. 이 프로토콜은 분광 광도계, HPLC와 같은 고급 장비를 사용합니다.
또는 FITR. 이러한 도구를 사용하면 연구 결과의 견고성이 향상됩니다. 우리는 미세아교세포에 대한 베타글루칸의 효과를 자신 있게 분석하고 보다 확실한 결과를 얻을 수 있습니다.
시간과 세계의 한계로 인해 우리는 소교세포에 대한 베타글루칸 연구로 프로토콜을 제한했습니다. 그러나, 대식세포 또는 T 세포와 같은 면역계로부터의 다른 세포들은 이 프로토콜 동안 용이하게 될 수 있다. 처음으로 이러한 프로토콜은 두 가지 다른 지식 영역을 결합합니다.
첫째, 특정 제품을 정제하기 위한 생명공학적 절차의 사용, 둘째, 면역 조절 특성을 테스트하기 위한 세포 배양 기술의 사용.
