PSD 분획에 비해, 수지상 filopodia-풍부한 분획 주위미미미한 시냅스상에 작용하는 시냅스 단백질을 식별할 수 있다. 우리는 식세포 캡 형성을 유도하기 위해 살아있는 뉴런을 사용했습니다. 이 기술의 주요 장점은 인공 창세기에 있는 액티브한 단백질이 수지상 filopodia 풍부한 분획에서 확인될 수 있었다는 것입니다.
먼저, 비타민 B5 100 mg, 콜린 염화물 100 mg, 엽산 100 mg, 이이노시톨 180 mg, 비타민 B3 100 mg, 비타민 B6 염산염 100mg, 티아민 염산 염수 100 mg을 사용하여 200x 비타민 믹스를 준비하십시오. 알리코를 50ml 튜브에 조심스럽게 섞어서 섭씨 20도에 보관하십시오. 리보플라빈 용액을 준비하려면 자기 교반기를 사용하여 500 mg의 초순수수에 100 mg의 리보플라빈을 녹입니다.
알리코를 50ml 튜브에 조심스럽게 섞고 섭씨 20도에 보관하십시오. 1개의 어금니 칼슘 이염화물을 준비하려면 마그네틱 교반기를 사용하여 50ml의 초순수수에 7.35그램의 염화칼슘을 용해시킵니다. 최소 필수 중간 제제용 염화칼륨 400 mg 6, 소덤 염화 800 mg, 중탄산나트륨 2, 200 mg, 나트륨 인산염 단일 베이직 이질158 mg, D-포도당 7, 000 mg, 마그네슘 200 mg의 황산염 이질, 200 mg의 마그네슘 을 사용하여 저온화, 900 mg의 마그네슘 을 사용해 줍니다.
다음으로, 자기 교반기에 일정한 교반이 있는 1ml 파이펫을 사용하여 MM에 1.8 ml의 어금니 칼슘 이산화물을 드롭 방식으로 첨가합니다. 그런 다음 염산을 추가하여 MEM의 pH를 pH 7.25로 조정한다. 그런 다음 MEM에 200x 비타민 믹스 5ml와 리보플라빈 용액 200마이크로리터를 추가합니다.
초순수수로 용액의 부피를 1000ml로 조절한다. 0.22 미크론 필터 시스템을 사용하여 용액을 필터링하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 10x DNase-1 스톡 용액을 HBSS 12.5 ml에 100 mg의 Dnase-1을 용해하십시오.
0.22 미크론 필터를 걸며 1.5ml 튜브에 알리쿼트하고 튜브를 섭씨 20도에 보관합니다. 아라-C 스톡 용액을 위해 8.93 ml의 초순수에 아라-C 25 mg을 녹입니다. 0.22 미크론 필터를 걸기, 1.5ml 튜브의 알리쿼트, 섭씨 20도에 보관하십시오.
도금 매체를 준비하려면 MEM 아미노산 용액 1ml, 어금니 HEPES 1ml 750 마이크로리터, B27 1ml, 200 밀리머 글루타민 125 마이크로리터, 페니실린-스트렙토마이신 250마이크로리터, 페탈바인 소 르스럼 2.5ml, 페탈소 소 소 스럼럼 2.5 ml를 혼합하십시오. 스톱 배지를 준비하려면 MEM 아미노산 용액 1ml, 어금니 HEPES 1개 소리터 750개, FBS 5ml, MEM 43.25 ml를 50ml 튜브에 섞어 주세요. HBSS를 준비하려면 15 밀리몰러 HEPES로 보충하고, HBSS 49.25 ml, 1 개의 어금니 HEPES 750 마이크로 리터를 혼합하십시오.
폴리 l-리신 코팅 요리 준비를 위해, 코팅 35 mm 플라스틱 세포 배양 접시 와 0.2 mg 의 폴리 l-리신 하이드로 브로마이드 의 ml 당 하루 25 섭씨. 다음으로, 초순수 2ml로 설거지를 세 번 씻고, 사용전까지 섭씨 25도에서 스톱 미디엄 1.5ml로 배양합니다. 해부 된 해마를 포함 하는 혼합물에 500 마이크로 리터 각 2.5%트립신과 10 X DNA-1 HBSS에 보충 15 밀리 머러 HEPES, pH 7.2, 3 분마다 교반과 함께 섭씨 37도에.
이어서, 정지 매체의 10ml로 해마를 옮기고 트립신을 비활성화하기 위해 섭씨 4도에서 5분간 배양한다. 다음으로 해부된 해마를 섭씨 4도에서 10ml의 신선한 정지 배지로 5분간 배양합니다. 해마를 신선한 정지 중간 10ml로 옮기고 섭씨 4도에서 5분간 배양합니다.
이어서, 15ml 튜브에서 정지 배지의 900 마이크로리터와 100 마이크로리터의 100 마이크로리터로 해마를 이동한다. 1ml 파이펫을 사용하여 20번 피펫을 사용하여 해마를 고립된 뉴런으로 해리합니다. 도금 매체 9ml를 추가하고 70 미크론 세포 여과기를 걸기하여 50ml 튜브에 넣습니다.
혈종계를 사용하여 세포의 수를 계산하고 도금 배지에서 밀리리터 당 네 번째 세포에 3.5 배 10으로 조정한다. 다음으로 폴리 l-l-lisine 코팅 요리에서 정지 매체를 흡인합니다. 코팅 된 요리에 세포의 접시 당 2 ml를 접시와 60-64 시간 동안 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 아래 배양.
인큐베이션 후, 신경에 Ara-C 스톡 용액 2 마이크로리터를 넣고 천천히 접시를 흔들어 줍니다. 문화 권식을 가습 상자에 보관하여 37도에서 이산화탄소 5% 미만의 배양 배지를 변경하지 않고 보관하십시오. 식기당 300만 개의 마그네틱 폴리스티렌 마이크로비드를 배양뉴런을 함유한 20가지 요리에 먼저 첨가하여 체외에서 13일 후에 수지상 필리포디아의 풍부한 분수를 정화합니다.
하루 후, 중간 및 무한 한 마이크로 비드를 제거 하는 3 번 생기와 PBS의 1 ml에 뉴런을 세척. PBS를 제거한 후, 리시스 버퍼의 접시당 500 마이크로리터로 뉴런을 lyse. 다음으로, 세포 스크레이퍼로 lysate를 수집하고 10 개의 저단백질 결합 마이크로 튜브로 lysate를 전달합니다.
자석 분리기에 튜브를 설정하고 1 분 동안 기다립니다. 상체를 수집하고 은 염색 및 서양 얼룩 분석에 대한 언바운드 분수로 사용합니다. 다음으로, 구슬을 새로운 저단백질 결합 마이크로튜브로 옮기고 자기 분리기에 1분 동안 설정한다.
상체를 완전히 제거하고 리시스 버퍼의 500 마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이 믹서를 사용하여 구슬을 15초 동안 씻으시면 됩니다. 구슬의 세탁을 10 번 반복하고 상체를 제거합니다.
1X SDS 샘플 버퍼의 50 마이크로리터를 첨가하여 구슬까지 엘루트 단백질을 넣고 5분 동안 98도에서 튜브를 끓입니다. 860xG 3000 RPM에서 10초 동안 튜브를 원심분리하고 튜브를 자기 분리기에 1분 동안 설정합니다. 상체를 수집하고 바운드 분획으로 사용합니다.
BCA 단백질 분석에 의해 결합되지 않은 단백질 분획의 농도를 측정합니다. 브로모페닐 블루로 프로티안 솔루션을 시각화하고 SDS 페이지의 마이크로리터당 5나노그램으로 농도를 조정합니다. 5-20%의 그라데이션 젤을 사용하여 SDS 페이지로 바운드 및 언바운드 분수를 분리합니다.
실버 얼룩 젤. 마지막으로, 원고에 따라 적절한 원차 및 이차 항체를 사용하는 서양 얼룩. 배양 해마 뉴런에서 TLCN은 수지상 소포디아, 샤프트 및 소마에 풍부하게 국한되고 F-actin과 공동 국화되었습니다.
인코딩 된 구슬은 주로 덴라이트에 묶여 있었고 뉴런 원더라이트에 TLCN과 F-actin을 축적하여 phagocytic cups의 형성을 유도했습니다. Thorecense 이미지는 phagocytic 컵 형성이 결정적으로 수상월에 TLCN의 존재에 의존했다는 것을 보여주었습니다. phagocytic 컵은 야생 형 해마 뉴런에서만 형성되었지만 TLCN 비효율적인 해마 뉴런에는 형성되지 않았습니다.
SDS 페이지 결과는 단백질 밴드 패턴이 언바운드 및 바운드 분획에 대해 거의 동일하지만 50 및 70 킬로달톤의 강도는 바운드 분획에 있는 것보다 낮았다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 밴드 강도는 TLCN 비효율적인 배양 해마 뉴런에서 제조된 언바운드 및 바운드 분수 사이에 분명히 다르지 않았다. 언바운드 및 바운드 분획의 서쪽 얼룩 분석은 TLCN과 VN이 주로 바운드 분획에서 검출되었다는 것을 보여주었습니다.
액틴, 에즈린, G 알파 q, PLC 베타 1, MAP-2 및 스펙트린은 바운드 및 언바운드 분획 모두에서 검출되었습니다. 모에신, PSD-95, 알파-액티닌 및 알파-투굴린이 언바운드 분수에서 검출되었다. 마이크로비드의 코팅 단백질이 변경되면, 이 절차는 분석 상호 작용을 확인하기 위해 적용될 수 있다.
이 기술은 인공 물질에 작동 하는 단백질을 식별할 수 있습니다. 그래서 우리는 기계장치 인공 창세기가 정량화될 수 있다고 믿습니다. 우리는 정신 장애와 관련되었던 새로운 단백질이 수지상 filopodia 가 풍부한 분수에서 확인될 수 있다는 것을 믿습니다.
그리고 치료에 확장 될 수있다.
