이 작품은 LABEX MemoLife에 의해 ARSEP에 의해 지원되었다 (Fondation 라 공들인 쉬르 라 sclérose EN 플라크 라모 보좌관을 부어)

1. 솔루션 및 재료 <ol><li> 분리 용기 용액을 제조 : B1, 150 ㎖의 HBSS에 1M HEPES 1.5를 가하여; B2는 20 B1의 ml의 덱스 트란의 3.6 g을 추가; B3는, B1의 100 ml의 BSA의 1g을 추가합니다. </li><li> 상단 나사 조임 부분 떨어져 바닥을 절단하여 필터 홀더를 수정합니다. </li><li> 면역 용액 제조 : 고정액, PBS pH 7.4의 4 % 파라 포름 알데히드를; 투과성으로는 / 차단 솔루션, 5 % 염소 혈청을 희석 PBS pH 7.4의 0.25 %에 트리톤 X100. 참고 : 고정 사용 일차 항체의 종류에 따라 다릅니다. </li></ol> 2. 해부 주 : 혈관 세포 배양 용으로 사용하지 않는 멸균 조건이 요구되지 않는다. <ol><li> B1 20 ㎖와 150 mL의 비커를 준비합니다. 얼음에 보관하고 공기 오염을 방지하기 위해 파라 필름 커버. </li><li> 깊이 INT를 추가 순수한 아이소 플루 란의 1 ㎖에 적신 작은 종이 타월로 후드 아래에 마우스를 마취케이지를 오. 마취는 발가락 핀치에 반응의 부족에 의해 확인됩니다. 자궁 전위에 의해 마우스를 죽여. 참고 :이 단계는 국가 및 기관의 규정에 따라 수행됩니다. </li><li> 옵션 : 혈액 콘텐츠 (24)을 제거하기 위해 PBS 1X의 20 ml의 심장 내 관류를 수행합니다. </li><li> 제 코에 목 메스 피부 멀리 당깁니다. PBS 1X 모든 오염 머리카락을 제거합니다. </li><li> 두개골을 열려면, 먼저 후각 망울에 전방 가위를 삽입하고 두 부분으로 두개골 파열 가위를 엽니 다. </li><li> 조심스럽게 뇌 주걱을 사용하여 뇌를 제거합니다. 이들이 혈관 제조 예 38을 오염 하듯 측뇌실에서 맥락총를 해부. 참고 : 선택 사항 : 최종 준비 실질과 뇌막 혈관을 포함 할 것이다. 소망하지 않는 경우, 수막 (38)에 의해 기술 된 절차에 따라, 박리 될 수있다. </li><li> TR얼음 B1 용액 함유 비이커에 뇌 ansfer. 최대 8 뇌를 함께 처리 할 수​​있다. </li></ol> 3. 뇌 조직의 균질화 <ol><li> 두 메스를 사용하여 수동으로하고 적극적이어서 약 2mm의 작은 조각을 획득 B1 용액에 뇌를 이길. </li><li> 400 rpm에서 20 스트로크를 수행이 자동화 다운스 균질 제제 균질화. 유리관 얼음과 공기 주머니의 형성을 방지하도록, 상하로 이동시 douncer의 상부 용액되어 유지되는 것을 보장한다. 여러 샘플을 준비하는 경우, 각각의 균질화 사이의 이온화 된 물 douncer을 씻는다. </li></ol> 4. 선박 정화 <ol><li> 4 ℃에서 10 분간 2,000 g에서 원심 분리하고 50 ml의 플라스틱 튜브로 옮기고 균질 진행. 더 관류가 수행되지 않은 경우 큰 흰색 인터페이스 (주로 미엘린)는 용기 펠릿 (적색의 상부에 형성 할 것이다). </li><li> 상층 액을 버린다. 선박 펠릿과 흰색 인터페이스가 함께 부착 상태로 유지됩니다. 얼음처럼 차가운 B2 용액 20 ㎖를 추가하고 1 분 동안 수동으로하고 적극적으로 튜브를 흔들. </li><li> 4 ℃에서 15 분간 4,400g에서 두 번째 원심 분리를 진행합니다. 미엘린 해주기 상등액의 표면에 조밀 한 백색 층을 형성 할 것이다. </li><li> 조심스럽게 튜브를 들고 천천히가 뜨는는 벽을 따라 통과 할 수 있도록 회전에 의해 튜브 벽의 수초 층을 분리합니다. 뜨는와 수초를 폐기하십시오. 혈관을 함유하는 펠릿을 상기 튜브의 하단에 부착 된 상태로 유지. </li><li> 5 ml의 플라스틱 피펫을 감싸 흡수 종이 튜브의 내부 벽을 가릴 모든 잔여 액을 제거, 혈관​​ 펠렛을 만지지 마십시오. 남아있는 액체를 배출 흡수 종이에 튜브 거꾸로하십시오. </li><li> 낮은 바인딩 팁, keepi 최대 피펫 팅에 의해 아래로 얼음처럼 차가운 B3 용액 1 ㎖에 펠렛을 일시 중단얼음에 튜브를 겨, 다음 (B3) 솔루션의 또 다른 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 선박은 가능한 한 분산 및 집계를 형성하지 않도록해야합니다. </li></ol> 5. 여과 <ol><li> 얼음처럼 차가운 B3 용액 30 ml의 얼음에 비커를 준비합니다. 공기 오염을 방지 할 파라 필름으로 커버. </li><li> 베커 플라스크의 상단에 변성 필터 홀더에 20 ㎛의 메쉬 필터를 배치하고 빙냉 B3 용액 10 ㎖를 가하여 평형화. </li><li> 필터상의 용기 준비 붓고 빙냉 B3 용액 40 ㎖로 혈관을 헹군다. </li><li> 깨끗한 집게를 사용하여 필터를 복구하고 즉시 B3 용액 함유 비이커에 젖어. 가볍게 흔들어 필터에서 혈관을 분리합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분간 2,000 g에서 50 ㎖ 플라스틱 원심 분리 튜브에 비이커 콘텐츠를 붓는다. </li><li> 주 : 또는, 단계 4.6에서 뇌 혈관 &#39;현탁액 100 ㎛ 메쉬의 필터로 여과 할 수있다.관류 후 상기와 같이 20 ㎛의 메쉬 필터로 여과되고 미세 혈관 (주로 모세관)를 포함하는 동안,이 경우에는, 큰 혈관 우선적 필터상에서 유지된다. </li><li> 빙냉 B3 용액 1 ㎖에 미세 혈관의 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브로 피펫 팅하여 옮긴다. 4 ℃에서 5 분간 2,000g에서 원심 분리기. </li></ol> 6. 고정, 투과성으로하고 차단 <ol><li> 1.0 ml의 낮은 바인딩 팁을 사용하여 PBS를 포함하는 0.2 ml의 PCR 튜브에 피펫으로 전송 선박. 그들이 팁의 바깥 부분에 부착 될 수 있으므로 혈관을 건드리지 않도록주의하십시오. 쌍안 현미경으로 다음의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 다음 매체 변화의 각각에 대해, 선박 바닥에 도달 할 때까지 얼음에 튜브를두고 긴 것은 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 액체의 대부분을 피펫. </li><li> PBS의 대부분을 제거하고 정착액 솔루션 200 μl를 추가합니다.부드럽게 흔들어 혈관을 일시 중단하고 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 정착액 솔루션을 피펫 및 1X PBS (제 1 세척) 200 μL로 교체, 실온에서 5 분간 배양하고이 단계를 3 회 반복한다. 때마다, 혈관이 제대로 혈관을 터치하지 않는 보장, 1X PBS 밖으로 튜브와 피펫의 바닥에 침몰했는지 확인합니다. </li><li> 마지막 세척 후, 수시로 부드럽게 흔들어 혈관을 재현 탁, 투과성으로 / 차단 솔루션에 의해 1X PBS를 교체하고 실온에서 1 시간을 품어. </li></ol> 7. 면역 염색 <ol><li> 투과성으로 / 차단 솔루션에 희석 일차 항체 (재료 템플릿 테이블에 여기 희석에 사용되는 항체의 참고 문헌 참조)의 혼합과 투과성으로 / 차단 솔루션을 교체하고 4 ° CO / N에 품어. </li><li> 실온에서 PBS에서 3 회 세척 한 후, 2 시간 동안 PBS에 희석 이차 항체의 혼합과 용기를 품어실온에서. </li><li> 참고 : 현미경으로 머리카락이나 먼지 오염 수에서 혈관을 구별하기 위해 (2,000 1) 또는 DAPI : 저희는 훽스트 (2,000 1)과 핵 염색을 수행하는 것이 좋습니다. </li><li> PBS에서 3 회 세척 한 후, PBS 50 μL에 재현 탁 선박. </li></ol> 8. 설치 및 관측 <ol><li> 실리콘이 유리 모세관과 팁을 준비 : 메스를 사용하여 P200 피펫 팁을 절감하고 내부의 모세관을 조정합니다. 모세관의 부피는 대략 40 μL이다. </li><li> 실리콘이 유리 모세관을 사용하여 유리 슬라이드에 혈관을 전송하고주의 깊게 흡수 종이로 액체를 제거합니다. </li><li> 선박에 장착 매체의 한 방울을 적용하고 드롭 슬립의 가장자리를 따라 확산 할 수 있도록 45도에서 커버 슬립을 개최합니다. 커버 슬립을 가자와 매체가 서서히 확산 할 수 있습니다. 그것은 건조 O / N 실온에서 빛으로부터 보호하자. 선박은 fluoresc으로 관찰 할 수있다엔트 공 초점 현미경. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

혈액 - 뇌 장벽의 CNS 내 및 생체 물질의 흐름을 조절 및 혈액에 존재하는 유해 물질에 대해 자신을 보호. 그것은 신경 퇴행성 질환 2, 뇌종양 (28)를 포함하여 여러 중추 신경계 병변에 참여하고있다. BBB의 매우 낮은 투과율 역시 신경 세포 및 뇌 연구 (3)의 매우 활성 인 필드에 대해 유해한 영향을 가역적으로 BBB를 열하려는 방법의 개발을 목표로 치료제의 통과를 방해한다. ...

중추 신경계 (CNS)의 적절한 기능이 고도로 조절 세포 외 환경을 요구하고, 그 요구는 다른 대사 기관 (1)에 비해 높아지고있다. CNS는 일반적으로 말초 기관에 무해하지만,에, 신경 독성 화학 물질의 넓은 범위에 매우 민감하다. 정확한 기능을 보장하기 위해, CNS &#39;혈관의 대부분의 내피 장벽을 형성하고; 분자 및 이온의 흐름뿐만 아니라 혈액 및 뇌 사이의 면역 세포의 통과를 제어하는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)은, 이렇게 저해 치료함으로써 적절한 항상성 (2)를 유지하지만, 또한 치료제의 침입을 제한 의 신경 학적 장애 3. 세포 수준에서, BBB는 주로 혈관 내피 세포, 유출 수송의 편광 표현과 매우 낮은 트랜스 사이토 속도 4 사이의 광범위한 꽉 접합에 의해 유지된다. 속성 및 BBB의 기능은 대부분 NE에 의해 유도되는ighboring 세포 4. 특히, 혈관 주위 세포는 BBB 5,6- 유도 및 유지에 중요한 역할을한다. 대형 선박을 둘러싼 평활근을 수축으로 세포이기 때문에, 혈관 주위 세포는 혈액의 흐름을 조절 7. 마지막으로, 성상 세포, 뇌의 주요 아교 세포, endfeet 주변라는 이름의 큰 프로세스를 보내 뇌 혈관 (8)의 대부분 BBB 무결성 및 면역 정지 (9), 신경 (10)에 대사 산물의 이동을 조절하고 신경 세포의 활동 사이의 밀접한 결합을 유도하고 혈류 11,12. 뇌 혈관 시스템의 분자 및 세포 특성을 연구 할 수있는 능력은 뇌 생리학과 physiopathology에 기여를 더 나은 특성을하는 것이 중요하다. 이 문제를 해결하기 위해, 뇌 혈관 뇌의 시스템을 분리 전략은 그대로 뇌 혈관 단편의 제조를 허용하는 개발되었다. 뇌 혈관 Purification 처음 특히 설치류 (14)에, 다른 종에 소 뇌 (13)를 사용하여 설명하고 개선 적응했다. 마지막 연구에서, 가변 크기의 필터의 사용은 다른 직경의 혈관이 풍부한 분획으로 뇌 혈관을 구분하기 위해 도입되었다. 흥미롭게도, 이러한 준비에, 내피 세포는 신진 대사 특성 (15), 수송 기능 (16)과 편광 (17)를 유지했다. 여기서는 자세하게 설명 프로토콜을 추가로 절연 혈관 시츄 그들의 구조의 대부분을 보유 함을 입증. 내피 세포가 단단히 접합으로 연결하고 연속 기저판에 의해 둘러싸여 유지. 주연 세포와 평활근 세포는 내피 층뿐만 아니라 혈관 주위 성상 세포 막에 부착 된 상태로 유지. 그러나, 성상 세포, 미세 아교 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포는 제거된다. 마지막으로, 우리는 고립 된 뇌 혈관에 면역 염색 수행하는 절차를 설명합니다. </P&gt; 지금까지 뇌 혈관 시스템에 관한 분자 세포 연구의 대부분은 해리에 의해 정제하여 뇌 혈관 세포에서 수행 된 세포 - 세포 분류 특정 리포터 마우스 균주 또는 면역 - 기반 방법을 사용하여 18, 19. 이러한 기술은 거의 순수한 뇌 세포 인구의 격리를 위해 수 있지만, 분리 된 세포는 완전히 다시 크게 분자 및 세포 특성에 영향을 미치는 그들의 현장에서 형태와 상호 작용을 잃게됩니다. 이 프로토콜은 특정 항체 또는 유전자 변형 마우스 얼룩의 필요없이 전체 뇌 조각의 분리를 허용, 여기에 설명 된 분자 특성에 영향을 줄이는 따라서, 보존되어 고립 된 뇌 혈관의 전체 구조와 같은 좋은 대안을 제공합니다. 최근에 기술 된 바와 같이 (20, 21)를 절연 용기는 BBB에서 유전자 활성, 단백질 합성 및 조절을 연구에 사용될 수있는 </suP&gt;. 마지막으로, 레이저 캡처 미세 절제 22, 23에 비해 본 프로토콜은 저렴 수행하기 쉽고 모든 실험실에 빠르게 적응할 수있다.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Grinder Size C</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>3431E25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5415&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811000320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low binding tips (P1000)</td>
			<td>Sorenson BioScience</td>
			<td>14200T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100&#181;m 47mm 100/Pk</td>
			<td>Millipore</td>
			<td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1014356290F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P10143263NR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;PARAFILM&#174; M (roll size 4 in. &#215; 125 ft)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Life technology</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&#174; 488 Conjugate; Dilution 1/100</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>I21411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td>
			<td colspan="2">kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>33-9100</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G3893</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti AQP4 (rabbit)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5971</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Cx43 (mouse, Clone&#160; 2)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610061</td>
			<td>&#160;dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Olig2 (rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&#160;dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti NF-M (mouse)</td>
			<td colspan="2">provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td>
			<td>&#160;dilution 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Iba1 (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>&#160;dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A11034</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor&#174; 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21424</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor&#174; 555 conjugate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A21429</td>
			<td>&#160;dilution 1:2000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of mouse brain vessels

뇌, 혈관 시스템의 대부분은 선택적 장벽 이루어져, 뇌 및 혈액 사이의 분자 및 면역 세포의 교환을 조절 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​. 더욱이, 거대한 신경 대사 요구 혈류 매 순간 규제를 필요로한다. 특히,이 규정의 이상은 대부분 뇌 병변의 병인 특징이다; 뇌 종양,뿐만 아니라 다발성 경화증, 수막염 및 패혈증 - 유도 된 뇌 기능 장애와 같은 염증성 질환 : 아교 모세포종, 뇌졸중, 부종, 간질, 퇴행성 질환 (파킨슨 병, 알츠하이머 병 EX)를 포함. 따라서, 뇌 혈관 생리학 변조 시그널링 이벤트 이해 주요 과제이다. 뇌 혈관 시스템을 구성하는 다양한 세포 유형의 세포 및 분자 특성에 많은 통찰력 갓 해리 뇌 조직에서 정렬 차 또는 배양 세포로부터 얻어 질 수있다. 그러나,휴대 극성, 형태 및 세포 간 관계와 같은 속성은 준비에서 유지되지 않습니다. 우리는 여기에서 설명하는 프로토콜은 구조적 일체 성을 유지하면서, 뇌 혈관 단편을 정제하기 위해 설계된다. 우리는 고립 된 선박이 연속 기저 얇은 판에 둘러싸여 꽉 접합에 의해 밀봉 내피 세포로 구성되어 있음을 보여준다. 주위 세포는 평활근 세포뿐만 아니라 혈관 주위 성상 endfeet 막은 내피 층에 부착 된 상태로 유지. 마지막으로, 우리는 정제 뇌 혈관에 면역 염색 실험을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

여기서는. 뇌 혈관 (14)의 기계적 분리를 허용하는 프로토콜을 기술 한이 기술의 주요 단계를 요약 한 도표. 뇌 혈관의 구조는 복잡하고 여러 유형의 세포를 포함한다 즉, 내피 세포 단단히 접합하여 밀봉하고, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 성상 세포 및 발 공정 (9)에 의해 둘러싸여. 따라서, 뇌 혈관의 단리는 다음, 우리는 프로토콜의 두번째 부분에...

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Purification of Mouse Brain Vessels

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

마우스 뇌 혈관의 정화

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.3K 조회수.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes. 

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

연구

신경과학

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, and a ventricular zone niche, which generates the inhibitory GABAergic Purkinje cells, which are neurons that constitute the deep cerebellar nuclei and Bergman glia. Recently, a third stem cell niche has been described that arises as a secondary germinal zone from the ventricular zone niche. The cells of this niche are defined by the cell surface marker prominin-1 and are localized to the developing white matter of the postnatal cerebellum. This niche accounts for the late born molecular layer GABAergic interneurons along with postnatally generated cerebellar astrocytes. In addition to their developmental role, this niche is gaining translational importance in regards to its involvement in neurodegeneration and tumorigenesis. The biology of these cells has been difficult to decipher because of a lack of efficient techniques for their purification. Demonstrated here are efficient methods to purify, culture, and differentiate these postnatal cerebellar stem cells.

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Demonstrated here is an efficient and cost-effective method to purify, culture, and differentiate white matter stem cells from postnatal mouse cerebellum.

출생 후 마우스 소뇌에서 프로미닌-1+ 줄기 세포의 정화

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...