우리는 우수 기술 지원 산드라 Bargen 감사합니다. 이 작품은 단백질 연구 부서 (PRD, TP A1.2 (RC와 TS), 그리고 문질러 연구 좋아, Rektoratsprogramme에 의해 지원되었다 -. wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) 단클론 항체 39.4D5와 F55A10이 발달 연구 하이 브리 도마에서 얻은되었습니다 은행 (DSHB, 아이오와시, IA).

특수 시약의 경우 : 탭을 참조하십시오. 1. 나열된 다른 모든 시약은 시그마 알드리치에서 얻은 세포 배양 등급 품질 있습니다. 1. 요리 / coverslips의 PORN-H/laminin 코팅 <ol><li> 150 MM의 borate 버퍼 산도 8.35에서 0.5 MG / ML 폴리 - DL - ornithine 브롬화 수 소산​​ (포르노 H)의 작업 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 50 MG 포르노 / 1 ML의 borate 버퍼의 주식 솔루션은 사전에 준비하고 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> 100 % 에탄올에 불타는하여 유리 coverslips을 소독하고 공기 건조 보자. </li><li> 4 밤새 충분한 포르노 H 솔루션 표면 ° C. 표지 </li><li> 다음날 소독 물, 공기 건조 coverslips로 세 번 씻어. </li><li> HBSS 2.5 μg / ML의 laminin의 작업 솔루션을 준비 <ol><li> Aliquots는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 ° C 즉시 사용하기 전에 4 해동. </li></ol></li><li> laminin 솔루션 포르노 H - 코팅 coverslips의 표면을 커버하고 사용하기 전까지 실온에서 최소 2 H에 대해 품어 보자. </li></ol> 2. 정화 접시의 렉틴 코팅 <ol><li> 멸균 물, 산도 9.5에서 10 mm까지 트리스의 솔루션을 준비합니다. </li><li> 10 μg / ML의 최종 농도 렉틴을 (HBSS에있는 렉틴 (시그마 L9640) 가루를 해결하는) 추가합니다. </li><li> 코트 렉틴 솔루션 8 ML과 10cm의 세포 배양 접시의 표면은 실온에서 최소 30 분 품어 보자. </li><li> 사용까지 HBSS에 HBSS 및 저장과 접시 세 번 씻으십시오. </li><li> 30mM KCl, 0.8 % (W / V) NaCl의 depolarisation - 솔루션을 준비합니다. 실온 (RT)에 여과하고 저장하여 소독. </li></ol> 3. Motoneuron 문화 매체 <ol><li> 해동 목마 혈청 4 박 ° C 55 °에서 inactivate 30 분 C, -20에서 5 ML 및 저장소로 나누어지는 ° C. 해동의 나누어지는 직접 RT에서 사용하기 전에. </li><li> 보관 -20 ° C. 1 ML aliqouts에서 B27 - 보충 사용하기 전에 바로 RT에서 B27 보충 해동. 동결과 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 나누어지는의 -20 ° C에서 0.5 ML aliquots 및 저장에 glutamax하고 1:100에서 사용합니다. </li><li> 10 μg / 0.1 % BSA와 소독을 물에 ML의 CNTF의 재고 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에 저장 </li><li> 2.5 ML 말 혈청, 1 ML - B27 보충 직접 사용하기 전에 0.5 ML glutamax와 46 ML neurobasal 매체를 섞는다. </li><li> 37 ° C. 10 NG / ML 매체와 사전 따뜻한 매체의 최종 농도 CNTF 추가 </li></ol> 4. 척수의 해부 <ol><li> E12.5 임신 마우스를 희생하고 조심스럽게 배아를 제거합니다. 완전히 배아를 커버하기에 충분한 RT HBSS를 추가합니다. </li><li> 머리와 꼬리를 제거하고 straddled 팔다리와 배아 뒤 측면을 놓으십시오. </li><li> 한 포셉와 배아를 수정하고 다른 포셉과 바깥쪽 피부를 제거합니다. </li><li> 그 아래 포셉을 천공하여 척수를 제거하고 척수의 양쪽에서 본 같은 움직임으로 들어올려. </li><li> HBSS로 새로운 접시에 격리 척수를 전송하고 지느러미 측면에있는 척수의 중심 채널을 엽니다. </li><li> 척수의 둘러싸고 meninges을 제거하여 지느러미 루트 신경을 제거합니다. </li><li> 최대 얼음 1 ML의 HBSS하고 저장 가득 eppendorf 반응 관의 렉틴 판 당 6 배아에 대한 준비가 완료되기 전까지의 척추 코드의 허리 부분을 수집합니다. </li></ol> 5. 렉틴과 기반의 정화에 의해 motoneurons의 농축 참고 : 다음 단계를 시작하기 전에, 여기에 최신은 (. 3 단계 참조) 매체를 준비하고 prewarm <ol><li> 4 100 ML의 HBSS, -20 ° C에서 저장 및 해동에 1g 트립신를 해결 ° C.하여 트립신 용액을 준비 </li><li> 믹스 1g 98 ML의 HBSS 1 M HEPES pH를 7.4 2 ML과 트립신 - 억제제는, 1 ML의 aliquots 4 ° C.에 보관해야 </li><li> 세포 배양 후드에 척추 코드와 튜브를 전송하고 조심스럽게 HBSS 700 μl를 제거합니다. </li><li> 7.5 μl 트립신 솔루션과 조심스럽게 반전 튜브로 믹스를 추가합니다. </li><li> 37 8 분 trypsination을 수행 ° C. </li><li> 30 μl 트립신 억제제를 추가하여 반응을 중지하고 더 이상 셀 집계 볼 때까지 1000 μl 피펫 팁과 함께 신중하게 10-15 시간을 피펫 아래 (씹다). 20-200 μl 피펫하고 해당 팁을와 분쇄를 반복합니다. </li><li> HBSS - 가득한 렉틴 판에 셀 솔루션을 피펫 부드럽게 접시를 회전하여 세포를 분산. </li><li> 진동이없는 표면에 RT 60 분 렉틴 접시 보관하십시오. 오염을 피하기 위해 그것을 커버. </li><li> 아주 부드럽게 HBSS를 제거하고 접시에게 세포 조각 및 첨부된 / 무소속하지 세포를 제거하는 사전 예열 HBSS와 함께 신중하게 4 번 씻는다. </li><li> 바로 마지막 세척 단계 후, 접시 500 μl depolarisation 솔루션을 추가하고 1min에 대해 품어 보자. </li><li> 흔들림으로 렉틴 구속 세포의 분리를 촉진하고번호판을 도청. </li><li> 2 ML 사전 예열 문화 매체와 15 ML 팔콘 튜브로 전송과 번호판을 입력합니다. </li><li> neubauer의 카운트 챔버와 휴대폰 번호를 계산합니다. </li><li> 플레이트 응용 프로그램에 따라 적절한 숫자 laminin 코팅 coverslips 또는 접시에있는 세포. </li><li> 일 1 오래된 매체의 50 %주의 교체하여 연속적으로 매초마다 하루에 매체 교환을 수행합니다. 항상 미리 예열, 신선한 새로운 문화 매체를 사용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 배아 motoneurons는 E12에서 E14로 마우스 배아에서 얻을 수 있습니다. 요추 척수의 전체 세포 인구로부터 2-3 %가 motoneurons로 구성되어 있으며, 지느러미 루트 ganglionic 뉴런은 물론 NTR - 긍정적인 p75 있으므로, 그것은 (렉틴 기반 preplating 절차를 시작하기 전에 이러한 세포를 제거하는 것이 중요합니다 개요를 보려면 다음) 그림 1과 그림 2를 참조하십시오. 둘째, meninges들은 제대로 렉틴 기반 preplating 절차 (그림 2, 그림 3)에 의해 제거할 수 없습니다로서뿐만 제외되어야 강력하게 나누어 세포를 포함합니다. 나쁜 경우에는 이들 세포는 문화 번호판을 자라다 수 있습니다. 그림 3B와 3D의 대표적인 사진도 (프로토콜의 단계 5.9 참조) 수행되었습니다 절차를 세척 후 낮은 세포 밀도에 대한 인상을 제공합니다. 배아 마우스 motoneurons의 문화는 일반적으로 다섯 위 이레 동안 유지됩니다. 이 기간 동안 세포가 최대 길이 (그림 4) 자신의 neurites을 설정합니다. Neurite 길이 강력히 접시 8 기판에 따라 달라집니다. 전형적인 기판 포르노 - H 대상 문화 요리에 코팅되어 laminin입니다. Motoneurons 또한 물 용해에 의해 생성된 8 세포외 매트릭스와 같은 다른 이하 정의 기판 위에 성장하실 수 있습니다. suboptimal 코팅, neurite 길이와 성장 원뿔 지역의 경우에 감소 및 세포 사망은 일반적으로 증가하고 있습니다. 영양 지원 문화 배아 마우스 motoneurons의 생존에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 영양 지원 6 않고 10 % 20 % 7 일째 드롭에 처음 도금 세포의 생존. 두뇌 파생 neurotrophic 인자 (BDNF)와 Ciliary neurotrophic 요소 (CNTF)는 가장 일반적으로 사용되는 요소지만 나머지는 잘 [백혈병 억제 인자 (난생), Cardiotrophin - 1 (CT - 1) 기본적인 fibroblast의 성장 인자는 (bFGF로 생존을 홍보할 수 ), 성장 인자 1 (IGF - 1) 9] 인슐린과 같은. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> 배아 마우스 motoneurons의 준비를 위해 그림 1. 흐름 방식. 회로도 그림은 마우스 배아 motoneurons의 격리와 문화에 대한 서로 다른 단계를 보여줍니다. 약어 : SC : 척수, HBSS : 행크스 균형 소금 솔루션, MN : motoneuron. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> 그림 2 E12.5 마우스에서 척수의 허리 부분의 분리 :.. E12.5 마우스 배아. 다음 단계에 대한, 머리와 꼬리를 제거하고 신체는 지느러미 접속 위치 B에 배치됩니다 지느러미 접속 위치에 배아. 척수의 왼쪽과 오른쪽에 집게는 위치에 배아 몸을 고정하고 있습니다. 포셉 중 하나는 이후에 피부를 잘라하고 다른이 위치에있는 배아를 해결하는 데 사용되는 척수 아래 절단하는 데 사용됩니다 C :. E12.5 마우스 배아에서 분리된 척수가. 척수 (허리, 가슴, 자궁 경부)의 부분이 표시됩니다. 척수는 meninges으로 둘러싸여 있으며, 지느러미 루트 신경의 일부는 여전히 그들에게 부착됩니다 D는 :. 척수는 길이 방향 중앙 운하쪽으로 그것을 열려면 지느러미 측면에 절단 E는 :. 복부 측면에 meninges 지금은 평평 척수 이륙. 참고 : 이륙하는 동안 허리 부분에 작은 상처로 표시됩니다 F는 :. 척수의 허리 부분만이 그 다음 추가 절차를 취합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> 그림 3 결단력과 E12.5 마우스 배아의 요추 척수의 섬 - 긍정적인 세포의 분리 :.. 섬 - 2분의 1 항체 배아 요추 척수 내에 라벨 motoneuron 열 (빨강, 화살표)와 Hoechst 라벨 모두 섹션 핵. E12.5 lumar 척수의 부분을 교차. E12.5 마우스 배아는 표준 절차에 따라, 6 H 4 %의 paraformaldehyde에 집중 - 고정 염분 인산 버퍼로 3 번 씻어과 자당로 치료했다. 20 μm의의 Cryosections는 그라 이오 스탯과 함께 찍은 사진과 섹션은 표준 절차에 따라 11 immunhistochemical 얼룩에 대한 처리되었습니다. 섹션 도자기는 이후 세포 핵의 국산화에 대한 Hoechst으로 표시. 참고지느러미 루트 ganglionic 뉴런은 잘하고 Islet-1/2-positive의 준비 절차는 격리 절차에서이 조직 부분을 제외 B :. E12에서 분류 섬 - 1 / 2 (빨강, 화살표) dissociated 요추 척수 세포. 5 배아, 왼쪽 - 전에 오른쪽 - 렉틴 기반 preplating 후. 세포는 모든 세포 핵을 시각화하기 위해 Hoechst와 counterstained되었습니다 C :. 렉틴 기반 preplating 전후 Islet-1/2-positive 세포의 부량 D :. 문화 한 다음날 E12.5 배아에서 Nkx6.1 분류 motoneurons가. 세포는 모든 핵 cisualieze에 Hoechst와 counterstained되었습니다. 모든 세포의 90 %가 긍정적인 Nkx6.1됩니다. 약어 : SC : 척수, MN : motoneuron, DRG : 지느러미 루트 신경절. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> 그림 4 E12.5 마우스 motoneurons의 Characterisation A와 B :.. 농축은 요추 척추 motoneurons이 체외 0 일 (0div)와 체외 (2div)에서 일 2 p75 NTR을 표현 E12.5 마우스를 고립. 전지는 4 % paraformaldehyde로 고정하고 그후 표준 절차에 따라 p75 NTR을 위해 얼룩되었습니다. 세포는 모든 핵을 시각화하기 위해 Hoechst를 사용하여 counterstained되었습니다 C는 :. 농축 motoneurons 문화 기판과 같은 포르노 - H 및 laminin에 대한 시험 관내 (5div) 5 일 후 및 β - III - tubulin에 대한 CNTF 자국의 존재 인치 세포가 긴 neurites을 성장주의와 더 이상 하나 (분기) 프로세스와 하나 이상의 짧은 프로세스 (axons과 dendrites)로 전형적인 motoneuron의 형태를 표시합니다. 약어 : MN : motoneuron; 사업부 : 체외에서 일. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> 렉틴과 기반 preplating없이 분해 후 </td></tr><tr><td> 세포 / SC의 총수 </td><td> Trypan 파랑 - 긍정적인 세포 [%] </td><td> Islet-1/2- 긍정적인 세포 [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995.0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889.4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> ± SD 의미 </td><td> 1.021.0 ± 147.1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> 렉틴과 기반 preplating로 </td></tr><tr><td> 이후 셀 수 preplating / SC </td><td> Trypan 파랑 - 긍정적인 세포 [%] </td><td> Islet-1/2- 긍정적인 세포 [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189.6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168.8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125.0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> ± SD 의미 </td><td> 161.1 ± 33.0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> 표 1. 특히 이런 목적을 위해 3 가지 격리 절차의 단계 E12.5에서 마우스 배아 motoneurons에 대한 대표적인 고립 절차 요약. 결과는 총 숫자 또는 백분율 번호 ± SD로 제공됩니다. 약어 : SC : 척수, SD : 표준 편차. <table border="1"><tbody><tr><td> p75 패닝 [%]로 섬 - 2분의 1 양성 세포 </td><td> 렉틴과 기반은 [%]를 패닝과 섬 - 2분의 1 양성 세포 </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 일 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> 표 2. 렉틴과 기반 및 p75 기반 한 패닝 motoneuron 셀 번호의 비교. 결과는 백분율 숫자 ± SD로 제공됩니다.

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	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 렉틴과 기반 preplating 기법의 장점은 p75 NTR 기반 패닝 절차보다 비싼 것이 있으며, 렉틴는 항체보다 더 안정적입니다. 농축는 그림에 나와있는. 2 탭. 절차는 세포의 유사한 숫자의 정화 수 있으며 이러한 세포의 과반수는 것을 보여주는 하나의 motoneuron 마커 섬 - 1 / 2 표현한다. 가장 중요한 단계는 요추 척수에 대한 격리 절차입니다. meninges과 DRGs (그림 2) 제거하면 렉틴 기반 preplating하여 다음 정화 절차 필수적입니다. 이것이 제대로 관리되고있다면, 거의 모든 세포는 (대표 사진 그림을 참조하십시오. 3a를) p75 NTR을 표현. 섬 - 1 / 2의 표현과 p75 NTR 가장 분명 차이에 대한 이유는 허리 motoneurons가 differentially 섬 - 1 / 2 10보다 높은 낮은 수준을 표현하기 때문에. 우리가 긍정 대 부정적인 세포 (Tab. 1)에 대하여 엄격한 것처럼 섬 - 2분의 1 표현의 낮은 수준의 경우 이것은 immuncytochemical 얼룩과 후속 계산에서 우리의 주목을 탈출 할 수도 있습니다. 또한, 표 1은 분명히 세포가 레스터 손상되었음을 나타냅니다 겨우 몇 trypan 블루 긍정적인 세포가로 분리된 세포가 건강한 상태에있는 절차를 생존 것을 보여줍니다. 이 바꾸는 절차는 또한 배아 생쥐에서 혼합 유전자형의 새끼의 단일 배아 따라서에서 motoneurons의 고립 수 있습니다. 결론적으로, p75 NTR 항체 6 패닝 절차이 대안이 비슷한가 없다면 동일한 용량을 가능한 응용 프로그램 범위의 관점에서 마우스 배아 motoneurons을위한 저렴하고 효율적인 대안 정화 방법을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 폴리 - DL - ornithine의 브롬화 수 소산 </td><td> 시그마 </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14,170 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 coverslips </td><td> 온도 </td><td></td><td> Ø 10 14mm </td></tr><tr><td> 렉틴 </td><td> 시그마 </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 접시 </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon 델타 표면 </td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> 각 배치는 MN 문화에 대한 검사를해야한다 </td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> 시그마 </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 </td><td></td><td></td><td> 스테인레스 스틸, 크기 4 또는 5 </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> 워싱턴 </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 억제제 - </td><td> 시그마 </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 섬 - 1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> 세포 배양 표면에 뜨는 </td></tr><tr><td> 안티 Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> 세포 배양 표면에 뜨는 </td></tr><tr><td> 안티 - p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 특정 시약 및 장비의 표.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

척추 motoneurons 일찍 배아 신경 시스템 개발을 통해 postmitotic 단계 향해 개발하고 이후 dendrites과 axons을 성장. 표현 Nkx6.1가 척추 motoneurons 1 고유의 전구체 세포되는 신경 튜브 Neuroepithelial 세포. postmitotic의 motoneurons 그들의 최종 위치를 향해 이동하고 척추 넓이 2,3 따라 열로 자신을 정리했지만. 이러한 모든 차별과 위치 motoneurons의 90 % 이상이 전사 요인에게 섬 1 / 2 표현한다. 그들은 사지의 근육뿐만 아니라 신체 내부의 장기들을 신경을 분포시키다. 다른 사람들과 motoneurons 일반적으로 두뇌 파생 neurotrophic 인자 (BDNF) 및 Neurotrophin - 3 (NT - 3), tropomyosin 관련 키나제 B와 C (TrkB, TrkC)의 고친 화성 수용체를 표현한다. 그들은 tropomyosin 관련 키나제 A (TrkA) 4을 표현하지 않습니다. 두 고친 화성 수용체 게다가, motoneurons은 낮은 친화 neurotrophin 수용체 p75 NTR을 표현 않습니다. p75 NTR은 성숙 neurotrophins를 바인딩시킬 고친 화성 수용체보다 모든 neurotrophins과 비슷하지만, 낮은 친화력있는 모든 neurotrophins을 바인딩할 수 있습니다. 배아 척수 내에서 p75 NTR은 독점적으로 척추 motoneurons 5 표시됩니다. 이것은 주변 세포 6 대부분의 세포를 정화 motoneuron 절연 기술을 개발하는 데 사용되었습니다. p75 NTR의 세포외 도메인에 대한 특정 항체 (패닝)의 도움으로 분리 motoneurons은 하나의 실험에 사용되는 항체의 양이 높은 패닝에 사용되는 접시의 크기로 인해대로 고가의 방법으로 밝혀졌다 있습니다. 훨씬 더 경제적인 대안은 렉틴를 사용하는 것입니다. 렉틴과은 특히뿐만 아니라 7 p75 NTR에 바인딩을 보여줘왔다. 다음과 같은 방법 대신 p75 NTR 항체의 preplating 절차 밀 배아 agglutinin을 사용하여 다른 방법을 설명합니다. 렉틴과는 p75 NTR 항체의 비교 아르 렉틴를 사용하여 p75 NTR 항체 및 정화 등급으로 매우 저렴한 대안입니다. 배아 척수에서 Motoneurons이 방법에 의해 격리 수 있으며, 생존과 neurites을 성장.

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Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

척수에서 마우스 배아 motoneurons를 분리의 대체 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 계정에 렉틴은 낮은 친화 신경 성장 인자 수용체 p75NTR에 바인딩할 수있다는 사실이 걸립니다. 이 렉틴과 기반 preplating는 p75NTR에 대한 특정 항체와 비슷한 정화 수 있습니다.

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

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Research

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Neuroscience

17.9K 조회수.  Ruhr-University Bochum. 척수에서 마우스 배아 motoneurons를 분리의 대체 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 계정에 렉틴은 낮은 친화 신경 성장 인자 수용체 p75NTR에 바인딩할 수있다는 사실이 걸립니다. 이 렉틴과 기반 preplating는 p75NTR에 대한 특정 항체와 비슷한 정화 수 있습니다.

비디오: Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

마우스 두피 Astrocytes의 분리와 문화

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...