복재 정맥은 관상 동맥 우회 수술 후 갑자기 동맥 상태에 노출됩니다. 기계적 스트레스에 대한 적응 반응을 이해하면 정맥 이식 실패를 예방하기 위한 치료 도구를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 내피 세포 분리 프로토콜은 매우 간단하며 콜라게나제와 함께 배양하기만 하면 됩니다.
최소한의 혈관 조작으로 평활근 세포와 섬유아세포의 오염을 줄일 수 있습니다. 인간 SVEC를 분리하고 전단 응력 및 주기적 스트레칭 하에서 배양하기 위한 프로토콜은 복재 정맥 이식 실패와 관련된 내피 세포 기능 장애에서 기계적 힘의 기여를 이해하는 데 필수적입니다. 이전의 내피 세포 배양은 세포 배지 보충제 측면에서 매우 까다롭습니다.
배양물인 인간 SVEC를 성공적으로 분리하기 위해서는 성장 인자를 추가하는 것이 필수적입니다. 일차 인간 복재 정맥 내피 세포 또는 인간 SVEC를 분리하기 위해 최소 2-3cm 길이의 복재 정맥 세그먼트를 수집합니다. 멸균 층류 후드 아래에서 작업하면서 정맥 세그먼트를 예열 된 PBS로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.
내강 내부의 모든 혈액을 제거하려면 피펫에 부착되고 PBS로 채워진 피펫 팁을 정맥의 한쪽 끝에 삽입하고 부드럽게 씻어냅니다. 세탁 흐름이 완전히 깨끗해질 때까지 세척하십시오. 그런 다음 멸균 면봉사로 정맥의 한쪽 끝을 막습니다.
용기에 밀리리터 콜라게나제 유형 2 용액 1 밀리그램을 조심스럽게 채우고 면봉사로 용기의 다른 쪽 끝을 닫습니다. 콜라게나제 용액으로 용기를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소의 가습 분위기에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용기의 한쪽 끝을 15밀리리터 튜브 위로 절단하여 다른 쪽 끝을 절단하기 전에 콜라게나제 용액을 수집합니다.
1-2 밀리리터의 PBS로 내강 표면을 플러시하여 콜라겐 분해 효소로 튜브 내부의 모든 분리 된 내피 세포를 수집합니다. 튜브를 실온에서 400G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거한 후, 추가 헤파린 용액을 함유하는 3 내지 4 밀리리터의 완전한 내피 세포 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킨다.
부피당 3% 중량의 젤라틴으로 미리 코팅된 60mm 세포 배양 접시에 세포를 플레이트합니다. 배지를 변경하지 않고 4일 동안 가습된 분위기에서 세포를 배양합니다. 그 후, 헤파린 보충제를 추가하지 않고 격일로 배지를 변경하십시오.
적혈구가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 플레이트를 검사합니다. 추출 후 1-4일 후, 정맥 세그먼트의 크기와 직경에 따라 위상차 현미경으로 인간 SVEC를 시각화하여 합류 정도와 조약돌 형태를 평가합니다. 세포가 70%에서 80%의 밀도에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 계속 교체합니다.
유량 챔버 슬라이드를 부피당 0.1% 중량 젤라틴으로 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다. 유체 유닛 및 10 밀리미터 저장조를 갖는 멸균 관류 세트를 평형화시키기 위해, 이들을 가습된 대기에서 밤새 배양한다. 전단 응력 실험을 위해, 200, 000 내피 세포를 100 마이크로리터의 배양 배지에 현탁시켜 젤라틴이 코팅된 유동 챔버 슬라이드 내로 시드하였다.
세포를 배양 표면에 부착시키기 위해, 세포를 4시간 동안 배양한다. 유체 장치에 관류 세트를 놓습니다. 저장소와 관류 세트를 약 12 밀리리터의 예열 된 완전한 내피 세포 배지로 채 웁니다.
관류 세트에서 기포를 제거하여 두 저장소의 수위를 5밀리리터로 평형을 이룹니다. 인큐베이터의 챔버 슬라이드 없이 장착된 관류 세트에 유체 장치를 놓고 전기 케이블을 컴퓨터 조절 펌프에 연결합니다. 펌프 제어 소프트웨어에서 사전 정의된 프로토콜을 실행하여 저장소와 관류 세트에서 모든 기포를 제거합니다.
층류 후드에 장착된 관류 세트가 있는 유체 장치를 취하여 합류 셀 단층을 갖는 슬라이드를 부착합니다. 인큐베이터에 슬라이드가있는 전체 장치를 배치 한 후 전기 케이블을 펌프에 연결하십시오. 펌프 제어 소프트웨어에서 슬라이드 유형을 선택하고 매체의 점도를 설정하여 유체 장치 설정을 조정합니다.
흐름 매개변수(Flow Parameters)에 전단 응력 값을 입력하고 사이클 지속 시간과 흐름 유형을 설정합니다. 그런 다음 재생 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 정적 대조군과 같은 흐름에 노출되지 않고 동일한 매체로 처리된 세포로 슬라이드를 유지하는 것을 잊지 마십시오.
실리콘 기반 윤활유를 25mm 6웰 등이축 로딩 스테이션의 상단과 측면에 도포합니다. 종자 400, 000 세포를 콜라겐으로 코팅된 6-웰 유연 바닥 배양 플레이트의 각 웰에 3 밀리리터에 현탁시켰다. 세포가 100% 합류도에 도달할 때까지 가습된 공기에서 세포를 배양합니다.
스트레치 프로토콜을 시작하기 전에, 예열된 PBS로 세포를 한 번 세척하고, 웰 당 3밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가한다. 인큐베이터에 윤활된 모든 로딩 스테이션이 있는 베이스 플레이트를 삽입하고 튜브를 텐션 셀 스트레칭 바이오리액터 시스템의 컨트롤러 장비와 적절하게 연결합니다. 각 배양 플레이트를 바이오리액터 시스템에서 제공하는 하나의 빨간색 개스킷에 부착합니다.
그런 다음 인큐베이터의베이스 플레이트에 넣으십시오. 적절한 진공 및 스트레칭 부하를 얻기 위해 4개의 배양 플레이트를 모두 베이스 플레이트에 놓습니다. 컨트롤러 장비와 컴퓨터 시스템을 켭니다.
FlexCell 제어 소프트웨어를 열고 연신율, 파형 모양, 주파수 및 시간의 백분율을 포함하여 원하는 요법을 구성합니다. 요법을 저장하십시오. 진공 시스템을 켠 다음 요법을 선택하고 컴퓨터 화면에서 시작을 클릭하여 스트레칭을 실행합니다.
실리콘 멤브레인이 움직이고 셀을 늘리고 있는지 확인하십시오. 부착된 내피세포는 추출 후 4 내지 10일 후에 관찰할 수 있었다. 그들은 처음에 전형적인 조약돌 형태를 나타내는 세포 클러스터를 형성합니다.
그들은 EC 마커 CD31과 VE-cadherin을 발현했습니다. hSVECs는 전단 응력 하에서 배양될 때 유동 방향으로 정렬된다. 72시간 동안 제곱센티미터당 20 다인의 전단 응력은 전형적인 기계 감응 유전자인 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현을 유도하여 전단 자극의 효과를 나타냅니다.
주기적 스트레칭 결과는 인간 SVEC에 적용되는 강도에 따라 다릅니다. 낮은 스트레치 하의 세포는 정적 세포와 유사한 피질 F-액틴 패턴을 보였다. 최대 72시간 동안 산화질소 방출의 변화 없이, 우리의 동맥 스트레치 수준은 24시간 후에 액틴 세포 골격을 리모델링하고 72시간 후에 NO 방출을 감소시켰습니다.
기계적 스트레스 연구 외에도 연구자들은 분리된 세포를 사용하여 내피 세포 기능 및 기능 장애에 대한 지식을 확장하기 위한 다양한 방법을 수행할 수 있습니다. 입증된 프로토콜에 따라 전단 응력 및 스트레칭 하에서 다른 유형의 내피 세포를 연구할 수 있습니다.
