저자는 베이커 재단과 Zerina Lokmic의 지원 로얄 어린이 재단 &#39;과학 원정대의 여성을 인정하고 싶습니다. 앤드류 G. Elefanty와 에두아르 G. 스탠리는 NHMRC 선임 연구 펠로우 있습니다. 자신의 실험실에서 작업은 NHMRC 및 줄기 세포 호주에 의해 지원되었다.

윤리 문 : 림프 기형 및 포피 조직의 수집을위한 윤리 승인 왕립 어린이 병원, 멜버른, 호주에서 인간 연구 윤리위원회로부터 얻은 것입니다. 서명 동의는 수술 전에 환자의 부모로부터 받았습니다. 조직 샘플은 선택 과목 할례를 받고 임상 관리의 일환으로 수술을받은 LMS 환자로 진단 환자에서 수집되었다. 모든 실험은 국립 보건 의료 연구위원회, 호주의 지침에 따라 수행되었다. 포피와 림프 기형 조직에서 세포 현탁액 1. 준비 <ol><li> 버퍼 및 미디어 준비. <ol><li> EGM-2 미디어를 따뜻하게 부드럽게 37 ° C의 물을 욕조에 키트의 구성 요소를 해동 상용화 EGM-2 MV 총알 키트를 사용하여 완전한 내피 세포 미디어를 준비합니다. 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에, 무균EGM-2 미디어에 각 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 일단 모든 구성 요소가 미디어에 추가, &#39;완전한 내피 세포 미디어&#39;등이 미디어를 참조하십시오. 사용하기 전에 내용을 혼합 멸균 50 ㎖ 피펫을 사용합니다. 참고 : 세포 배양에 관한 모든 단계는 클래스 II 생물 학적 캐비닛에서 수행됩니다. 모든 솔루션은 제조자의 지시에 따라, 4 ℃에서 보관하고 사용하기 전에 실온으로 가온된다. 완전한 내피 세포 배지, 세포 배양, 효소 및 버퍼 용액은 사용하기 전에 20 분 동안 37 ℃에서 가온된다. </li><li> 50 NG / ㎖ VEGF-C와 완전한 내피 세포 미디어를 보충합니다. 사용까지 4 ° C에서 50 ml의 멸균 튜브 및 저장소로 보충 내피 세포 미디어를 나누어지는. 4 ℃에서 저장 될 때 매체는 적어도 4 주간 안정하다. </li><li> 8.752 g의 염화나트륨, 1.416 g의 나 2 HPO을 용해하여 칼슘, 마그네슘 무료 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비 4 · 2H 2 O 및를 1,000 ml의 물에 0.395 g의 KH 2 PO 4. 7.4으로 산도를 조정합니다. 필터는 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 PBS를 소독. (: 100 1에서 사용) 안티 곰팡이 / 항생제 솔루션을 추가 사용하기 전에. </li><li> 인간 피브로넥틴 준비 멸균 수 10ml에 1 mg의 피브로넥틴을 용해. 스토어는 -20 ° C에서 100 μL 분취에 솔루션을 재구성. 사용의 일 피브로넥틴 분취 량 100 ㎕로 멸균 PBS 10 ㎖를 추가 ON (10 μg의 / ㎖의 최종 농도로 작업을 얻었다). </li><li> 효소 매체를 들어, 멸균 PBS에 0.​​04 % 디 스파 아제 (Dispase) II, 0.25 % 콜라게나 제 II 0.01 %의 DNase I을 함유하는 용액을 제조 하였다. 첫째, 멸균 50 ㎖ 튜브에 디스 파제 및 콜라게나 제, 장소 무게 PBS의 필요한 부피를 추가하여 용해하여 37 ℃에서 진탕하면서 30 분간 배양한다. 일단 바이오 안전성 후드 필터 소독 (0.22 μm의 필터) 디스 파제 / 콜라겐 솔루션, 용해. 무균 37 ° C에서의 DNase I. 스토어에게까지 효소 용액을 추가사용합니다. 참고 : DNase의 내가 멸균 동결 건조 분말로 사용할 수있는 상용 세포 배양 등급 시약입니다. </li></ol></li></ol> 포피와 림프 기형에서 세포 현탁액 2. 준비 <ol><li> DMEM / 2 % 항생제 항진균제 용액 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브를 단다. 이 튜브는 조직 수집을 위해 사용될 것이다. </li><li> 기형 및 림프 조직 포피 제거 수술에 이어, 무균 세포 배양 실험에 얼음 이송 튜브와 티슈 시편을 추가한다. </li><li> 조직을 포함하는 튜브의 무게를 측정하고 조직의 무게를 계산한다. 조직을 소화하는 데 필요한 효소 용액의 부피를 계산하는 가중치를 사용하여이. </li><li> 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에, 100mm 조직 배양 접시에 조직과 미디어를 전송하는 멸균 집게를 사용합니다. 미세 ~ 1mm 3 조각으로 조직을 말하다에 멸균 가위를 사용합니다. </li><li> 전송 다진 조직 미디어 나 혼합멸균 DMEM / 2 % 항생제 항진균제 용액 10 ㎖를 추가로 함유하는 50 ㎖ 튜브 NTO. 조직을 다시 중단 반전 섞는다. 5 분 동안 300 XG에 샘플을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거합니다. 티슈 중량을 기준으로, 예열 (37 ° C) 콜라게나 제 II 다진 조직의 100 mg의 당 /의 DNase I / II 스파 아제 (Dispase) 분해 액 1ml를 추가한다. 일반적 다진 조직의 약 1g위한 효소 용액 10 ㎖를 사용한다. </li><li> 상수는 200 rpm으로 진탕 20-90 분 동안 37 ° C의 배양기에서 조직을 품어. 이 기간의 끝에서, 즉, 거의 모든 조직의 미세 파편으로 절단되어 있는지. 주 : 기본 조직에 영향 세포 생존율로부터 분리시 콜라게나 제와 디스 파제에 세포의 노출. 우리는 섬유 성 림프 기형 샘플을 소화 60 ~ 90 분을 필요로하는 반면 대부분의 신생아 포피 샘플을 최적으로, 소화 20 ~ 30 분을 필요로하는 것이 경험적으로 발견했다. LM LEC 수율S는 현재 섬유증의 양에 의해 영향을 받는다, 더 섬유 조직 아마도 인해 콜라겐 II와 디스 파제 II에 장기간 노출의 해로운 효과, 적은 수의 세포를 얻었다. </li><li> 소화 후, 바이오 안전성 캐비닛에 튜브를 전송하고 멸균 50 ML 튜브에 넣고 70 μm의 스트레이너를 통해 소화 조직 솔루션을 전달합니다. 세포 외 기질의 작은 흔적이 관찰 될 때까지 고무 플런저 3 ㎖ 주사기 피스톤을 사용하여, 나머지 조직을 분쇄. </li><li> 체질하고, 효소를 실활 붙어 균체를 회수 효소 매체 해리 볼륨 내피 세포 배지 당량 부피 셀 스트레이너을 씻는다. 예를 들어, 다진 조직 소화 효소 해리 배지 2㎖를 들면, 효소를 불 활성화 내피 세포 배지 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 5 분 300 XG에 셀 솔루션을 원심 분리기와 뜨는을 대기음. R&gt; 10 ml의 PBS에 세포를 E는 일시 중지. 300 XG에 원심 분리기 세포5 분 후, 두 번 세포 세척을 반복 뜨는을 제거합니다. &gt; 내피 세포 배지 20ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 트리 판 블루를 사용하여 시드 다음 세포를 2 × 개수&gt; 150cm 6 셀&gt;이 플라스크 내피 세포 배지 20 ㎖의 최종 부피 피브로넥틴 프레 코트. 가습 공기 인큐베이터에서 5 % CO&gt;이 37 ° C에서 문화.&gt; 참고 : 트리 판 블루 배제 추정으로 유핵 세포의 75 % -90 %가 조직 소화 살아남을 것으로 예상된다. 초기 세포 수는 세포 현탁액의 모든 유핵 세포 (즉, 각질 세포, 백혈구, 대식 세포, 연결 조직 세포 및 혈관 세포)를 반영한다. 5~7일에서 세포 수는 부착 생존과 세포 배양 동안 증식 한 세포를 반영한​​다. 피브로넥틴과 조직 배양 플라스크를 코팅하면 다음 LEC와 LM LEC 생존을 향상시킵니다. </li><li> 하룻밤 배양 후, P와 세 세척에 결합되지 않은 세포를 씻으BS / 1 % 항생제 항진균제 솔루션과 신선한 내피 세포 매체를 추가 할 수 있습니다. 효과적으로 플라스크에 존재 언 바운드 세포와 적혈구를 제거하는 세 가지 세척을 수행하십시오. 모든 둘째 날 미디어를 변경합니다. 세포 5-7 일 후 ~ 80 %의 합류 될 것입니다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 대한 림프 내피 세포 표면 마커에 대한 세포의 3 항체 염색법 <ol><li> 세포를 PBS로 80 % 합류, 흡 매체 린스 세포에 도달 한 후. </li><li> 이러한 150cm, 37 ℃에서 5 ~ 7 분 동안 2 플라스크 당 Accutase로 세포 분리 솔루션의 7 mL를 세포를 배양하여 부착 세포를 분리합니다. </li><li> 수확 분리 세포는 내피 세포의 매질 (3) 볼륨을 첨가하여 세포 분리 용액을 비활성화 및 새로운 멸균 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 5 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. </li><li> 기음 뜨는 및 PBS의 5 ml의 세포를 다시 일시 중지합니다. 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포의 제거upernatant는 세포 세척을 반복합니다. PBS 5ml에 세포를 다시 일시. </li><li> 생존 세포 수를 계산. 0.4 % 트리 판 블루 90 μL와 세포 현탁액의 10 μl를 섞는다. 이 서스펜션의 전송 10 μL은 계산을 위해 혈구합니다. 주 : 최종 세포 수율이 처리 된 표본의 크기에 따라 달라집니다. 가능한 세포의 7 × 10 5-1.2 × 106에서 150cm 2 플라스크 범위 당 보통의 세포 수율. </li><li> 세포 얼룩에 대한 항체 솔루션을 준비합니다. 참고 : 다음 희석 100 μL의 염색 볼륨 1 × 10 6 염색에 대한 적정 하였다. <ol><li> 희석 PE 접합 마우스 항 인간 VEGFR-3 (1시 50분); PE-Cy7 공액 접합 마우스 항 인간 CD34 (1 : 200); APC 접합 마우스 항 인간 CD31 (1 : 100) 및 알렉사 488 공역 랫트 항 인간 PODOPLANIN (1 : 200) 100 μl를 조직 샘플 당 멸균 5 % FBS / PBS 용액의 총 부피이다. 의 준비에 따라항체 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. 마찬가지로 게이트 유세포의 설정을 용이하게하기 위하여 묽은 이소 타입 대조군 항체의 혼합물을 제조한다. </li></ol></li><li> 항체의 결합 특이성 줄이기 위해 원심 분리기 세포 2 분 300 XG에는, 상층 액은 다음 멸균 5 % FBS가 / 샘플 당 PBS 용액은 염색 할 100 μL의 세포를 중단 제거합니다. 4 ℃에서 20 분 동안 얼음에 세포를 품어. </li><li> 5 분 300 XG에 원심 분리기 세포는 공액 항체 칵테일의 세포를 일시 중지 한 후 다시 뜨는을 제거. 또한, 100 ㎕의 이소 타입 대조군 항체 혼합물에 세포 (1 × 105)의 작은 부분 표본을 염색. 20 분 동안 얼음에 세포를 품어. </li><li> , 언 바운드 항체를 제거하는 5 분 동안 300 XG에 FBS / PBS 용액과 원심 분리기에게 세포를 2 % 2 ㎖를 추가합니다. 뜨는을 기음과 세척을 반복합니다. </li><li> 이소 제어 및 항체 염색 표본 세포 펠렛을 재현 탁 것은 / ㎖ 프로피 듐 IO 0.5 mg을 300 μL로 정렬 될dide / 2 % FBS / PBS 용액. 정렬 될 때까지 얼음에 튜브를 놓습니다. </li></ol> 4. 셀 정렬 <ol><li> 악기를 설정하기 위해 다음과 같은 물질을 사용; 예컨대 Accudrop 형광 구슬 같은 상업적으로 이용 가능한 형광 입자, 인산염 완충 식염수 기반 시스 유체 및 드롭 지연 구슬 같은 정렬 구슬. </li><li> 다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬 기기에 정제 된 인간의 수정체 상피를 분리합니다. 악기를 설정하고 제조업체의 권장 사항에 따라 정렬합니다. 또한, 보상 매트릭스를 생성하기 위해 각각의 정렬로 단일 얼룩 보정 제어를 실행하고, 따라서 이러한 PE-사이클 채널에 PE로 형광 색소의 발광을 통해 상당한 출혈을 제거하기 위해. 주 : 100 ㎛ 노즐이 사용되며, 세포가 혈관 내피 세포 배지로 정렬되는 경우 세포 정렬 FACS의 비율이 높은 절연을 생존. </li></ol> 5. 세포 배양 후 FACS 정렬ING <ol><li> 5 분 동안 300 XG에 정렬, 원심 분리 후 세포. 뜨는을 대기음 (셀을 배정 할 플라스크에 따라 다름) 미디어의 5 ~ 10 ml의 세포를 재현 탁. 50,000 미만의 셀들이 정렬되는 경우, 세포가 피브로넥틴 코팅 25cm 2 플라스크에서 배양된다. </li><li> 그렇지 배양 5 % CO 2, 공기 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 75cm 2 피브로넥틴 - 코팅 된 플라스크에서 세포. 이일 후 미디어를 변경합니다. 주 : 매체의 변화 사이의 시간을 연장하는 것은 비 내피 세포의 생존을 선호하는 나타나기 때문에 셀 미디어는 매초마다 하루 변경됩니다. 세포가 더 확장 (15)에 대한 첫 번째 분할 때 PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 및 CD31 : 우리는 마커의 면역 검출을 사용하여 림프 내피 세포의 표현형을 확인합니다. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+coding+regions+of+VEGFR3+and+VEGFRC+in+Milroy+disese+and+other+primary+lymphoedemas.">Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas.</a> Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

수정체 상피 유체 항상성, 외래 항원 흡수 및 일부 영양소의 수송에 대한 면역 반응을 유지하는데 중요한 역할을한다. LEC 항상성은 박테리아 감염 및 종양 전이와 같은 질병 과정에 의해 영향을받을 수 있지만, 수정체 상피 또한 영향을받는 환자에 대한 역기능 림프관 형성 및 이환율을 초래할 체세포 돌연변이를 개발할 수있다. 생체 이식 및 생체 외 실험을 통해 림프 기형 병인 더 ?...

림프계 혈관 시스템의 주요 기능은 림프, 지질, 단백질 및 세포 성분을 함유하는 과량의 간질 유체를 흡수하고, 피 정맥 시스템으로 수행 할 수있다. 임파 모세 혈관의 네트워크가 외부 항원, 면역 감시 및 외래 항원을 중화 백혈구의 전개에 중요한 프로세스의 존재에 대해 스크리닝 림프절 림프 지시한다. 단방향 림프계 초기 림프 모세관, 림프 엔트리 1,2- 허용 특화된 세포 접합부와 박벽 평면 내피 세포의 단일 층을 가진 불연속 독특한 구조와 조직에서 시작한다. 이러한 증가 된 모세관 압력 간극 (3)의 존재 하에서 혈관 붕괴를 방지하기 위해 필라멘트를 고정 통하여 인접 결합 조직 매트릭스에 부착된다. 림프 모세관 수집에 빈 초기 림프 모세 혈관그 큰 림프관이나 혈관에 합체. 비교 림프관 두껍게 혈관벽, 페어링 림프 밸브가 몇 평활근 세포 (4)를 포함하는 불연속 기저막에 의해 이탈되어 수집 임파 모세 혈관 최초. 평활근 세포의 협정 개구 및 림프 밸브 폐쇄 및 수축은 림프 (3)의 흐름을 용이하게한다. 흉관과 오른쪽 림프관 : 인간에서, 신체의 여러 지역에서 림프계 혈관 두 림프 덕트를 형성하기 위해 병합 림프계 줄기를 형성하는 조인. 흉관 가슴 아래 신체의 좌측에서 우측에서 림프 배수 동안 머리, 목 및 가슴의 오른팔과 오른쪽에서 오른쪽 림프관 배수 림프절. 두 덕트 목 5 쇄골 하 정맥에 림프를 실시하고 있습니다. 림프 시스템의 장애는 크게 취득으로 그룹화ND 선천성 (표 1). 취득 조건의 예는 림프관과 이차 림프​​ 부종이다. 림프관 염 인해 세균 감염에 림프관의 염증이다. 영향을받는 림프관은 팽창과 삼출물 포함 다형 핵 세포를 입력합니다. 피부, 이러한 림프관은 종종 관련된 배수 림프절 (임파선 염) 6의 확대와 함께 빨강, 고통스러운 피하 줄무늬로 볼 수 있습니다. 차 림프 부종은 림프관 또는 림프절 방해 손상 또는 방해의 결과로 발생한다. 이는 손상이나 장애물에 림프 말단의 축적으로 만성 진보적 인 팽창에 연결됩니다. 선진국에서는 이차 림프​​ 부종은 가장 일반적으로 전이되는 종양 림프관 또는 림프절을 방해하거나, 항암 요법의 결과로서 림프절, 조사 후 섬유증 및 염증 후 throm 제거 수술 따라 악성 종양과 연관된bosis 및 흉터 7. 세계의 다른 부분에서, 이차 림프 부종은 사상충 6으로 기생충에 의한 림프 방해에 보조 할 수있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="4"> 림프 혈관 시스템의 장애 </td></tr><tr><td> 획득 한 </td><td colspan="3"> 타고난 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 림프절염 이차 림프​​ 부종 </td><td> 차 림프 부종 (10) </td><td> 산발적 림프 기형 (13) </td><td> 증후군 (13)와 림프 기형 관련 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 예를 들어, Milroy는 증후군 Meige 증후군 </td><td> 간단한 : 림프 기형 </td><td rowspan="2"> 예를 들어, Klippel-Tranaunay 증후군 공원 웨버 증후군 스터 지 - 웨버 증후군 </td></tr><tr><td> 결합 : 모세관 - 림프 기형 모세관 - 림프 - 정맥 기형 모세관 - 림프 - 동정맥 기형 모세관 - 림프 정맥 - 동정맥 기형 </td></tr></tbody></table> 림프 혈관 시스템의 장애 표 1. 개요. 림프계의 선천성 장애는 유전 적 돌연변이, 림프관 확장증과 림프 시스템 8,9의 이상에 의해 발생하는 것으로 생각 차 (특발성) 림프 부종을 포함한다. 차 림프 부종은 아마 드 노보 돌연변이에 의해 발생, 또는 상속 산발적 될 수 있습니다. 림프 질환은 또한 단리 될 또는 더 일반화 증후군 (10)의 일부를 포함 할 수있다. 림프의 소아에서, 97 %림프 부종은 지역적 배수 (11)을 손상 림프관 구조 이상으로 산발적이다. Milroy는 질환은 출생시 분명 또는 직후 12 VEGFR-3 유전자의 돌연변이에 의해 발생 차 림프 부종의 예입니다. 대부분 가족 상태이지만, Milroy는 질환도 Milroy는 질병 (32)의 가족 병력이없는 영아에서 확인 할 수있다. 어떤 림프 부종의 정도는 림프 생산 및 정맥 순환 6 림프를 다시 수송 능력의 양에 따라 달라집니다. 임상 양상과 현장 내피 세포 증식에 본사를 둔, 림프계의 이상은 림프 종양 또는 림프 기형 (13)으로 분류된다. Kaposiform lymphangiomatosis는 LEC 암 (14)의 예이다. 림프 기형은 배아 개발하는 동안 발생 및 아동 (15, 16)에 비례하여 증가 할 것으로 생각된다. 그들은 거의 퇴화 없지만 remai 수 있습니다N 증상이 외상이나 감염은 임상 적 합병증에 이르는 빠른 성장을 침전 될 때까지. 상기 한 정맥 순환에 조직에서 림프 네트워크 및 림프의 전도의 질서 구조는 림프 유체로 채워진 이상 낭성 구조의 지역화 된 컬렉션을 구성 림프 기형에 교란된다. 이러한 낭포 성 혈관들이 기능 림프 밸브를 포함하는 림프 순환에 연결 또는 것을 임상 적 또는 실험적 증거는 없지만, 자신의 림프 ID는 같은 PODOPLANIN, CD31, 림프 혈관 내피 세포의 수용체 1과 림프 세포 마커의 범위의 발현에 의해 확인 (LYVE-1), 프로스페로의 호 메오 박스 단백질 1 (PROX-1) 및 VEGFR-3 15,17,18. 이 낭성 구조는 하나의 작은 (microcystic) 또는 대형 (macrocystic)을 할 수 있지만, 대부분의 림프 기형은 microcystic과 macrocystic 구성 요소 (그림 1) (16)을 모두 포함한다. 수술 후, injectioN 경화 요법 및 / 또는 무선 주파수는 림프 기형은 종종 다시 발생 절제. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> 인간의 림프 혈관과 림프 기형의 그림 1. 형태론. 보통 사람의 림프 (A)와 PODOPLANIN에 항체로 표지 림프 기형 혈관 (B와 C) (갈색 라벨, 화살표). 인간의 림프 기형 혈관이 현저하게 팽창과 루멘의 크기에 상당한 변화를 특징으로한다. 이러한 지역화 이상 낭성 구조는 작은 (microcystic, *) (B) 또는 대형 (macrocystic, #) (C)이 될 수 있습니다. 대부분의 림프 기형 모두 microcystic과 macrocystic 구성 요소가 포함되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> &lt;/ P&gt; 일부 연구자들은 림프 기형은 수정체 상피의 이상 성장 가능성이없는 대신 정상적인 순환 (19)에 연결하는 데 실패하는 림프 혈관의 발달 장애를 나타내는 것을 제안했다. 그러나, 우리는 LM 수정체 상피 빠른 증식과 수정체 상피 (15)가 LM 수정체 상피에서 일차 결함이 있음을 시사 포피 아폽토시스보다 더 내성임을 발견 하였다. LM 수정체가 마우스 이종 이식 모델에서 이식되는 경우, 그들은 림프 기형 15 연상 구조를 형성한다. 이것은 림프 기형은 태아의 개발 과정에서 LM 수정체 상피에서 발생 하나 이상의 체세포 돌연변이에 의해 발생 될 수 있음을 가설을 지원합니다. 사실, 최근의 보고서는 포스-3 키나제 (PIK3CA) 유전자 (20)의 p110α 촉매 서브 유닛에 하나의 돌연변이를 확인했다. DNA 염기 서열 기술, 관련 돌연변이의 C의 발전을 감안할 때울드는 더 쉽게 이러한 조건의 미래 연구를 안내, 고립 된 LM 수정체 상피에서 확인 될 수있다. 가능한 수정체 상피의 분리가 감소 영양소 가용성 또는 프로 - 세포 사멸 에이전트 (15)에 대한 응답 등의 이동, 증식, 튜브 형성 능력과 생존 등의 분석에서 비정상과 정상 수정체 상피 사이의 비교를 용이하게한다. 고립 된 수정체 상피 더 새로운 LEC의 소집단을 묘사하기 위해, 세포 특이 유전자 발현 및 단백질 체학 연구를 수행 할 수있게하고 림프 기형의 임상 관리에 적합한 새로운 약리 에이전트를 발견 할 것입니다. 우리는 이전에 신생아 포피과 림프 기형 15 수정체 상피의 자기 비드 분리에 따라 LEC 분리 방법을 발표했다. 우리는 CD31 양성 선택에 NEG CD34 세포 분획을 실시 하였다 CD34 발현의 유무에 기초하여 혈관 내피 세포에서 정상 및 질병 수정체 상피를 분리 전략을보고했다.그러나,이 방법은 잔류 비 - 내피 세포의 존재에 의해 방해 하였다. 이는 후속 결합 조직 분해 이전 표피를 제거 독립적이었다. 이러한 오염 물질은 일반적으로 더 빠르게 증식하므로 결국 LEC 분리를 반복하는 후속 시도에도 불구하고 내피 세포 배양을 overgrew. 실제로, 2 ~ 5 %의 낮은 비 - 내피 세포의 초기 오염 LEC 인구 (15)을 압도하기에 충분했다. 이 LEC 세포 수율과 순도를 향상시킬 수있는 옵션으로 형광 활성 세포 정렬 방법을 탐구하는 우리를 자극했다. 또, CD34 CD31 순위 낮음 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 수정체 상피를 식별하는 선택 마커 및 VEGFR-3을 첨가 PODOPLANIN, LEC 개체군의 특이성을 향상시키기 위해 분류 다중 파라미터를 사용했다. 이러한 마커를 선택하기위한 이론적 근거는 보고서를 기반으로 한 것 수정체 상피 및 혈액 혈관 내피 가전 동안혈액 혈관 내피 세포에 비해 21-23 LLS 예컨대 CD31 같은 공통의 많은 세포 표면 마커를 가지고, 수정체는 CD34, PODOPLANIN 및 VEGFR-3 세포 표면 마커의 발현에서 표현형 변화를 나타낸다. CD31는 또한 혈소판 내피 세포 부착 분자 1 (PECAM-1)로 알려진 130 kDa의 막 횡단 당 단백질이다. 그것은이 혈액과 림프 혈관 21,24,25 모든 유형에서 발현되기 때문에 범 내피 세포 마커로 간주됩니다. CD34는 대부분의 조혈 전구에 110-kDa의 횡단 당 단백질 존재하고 세포, 혈관 내피 세포와 일부 림프관 26 줄기. VEGFR-3, 혈관 내피 성장 수용체, C 및 D 요인 마우스 배아 현상 정맥에 초기에 존재하지만 전사에 의해 규제 림프 명세서에 이어 (SOX) -18, C의 hicken을 SRY 관련 HMG-상자 요인 O valbumin U pstreaM p를 romoter T는 ranscription f를 배우 2 (COUPTF-II) 및 PROX-1, VEGFR-3 정맥 표현이 손실되고 이는 배아 수정체 상피 25, 27로 제한된다. PODOPLANIN는 38 kDa의 막을 mucoprotein, 최초의 마우스 배아 발달 (28)의 약 배아 림프관 일 (11) (~ E11.0)에 주목하고 강력하게 미세 혈관 림프 혈관, 림프 기형에 macrocystic 림프 내피 세포에 의해 PODOPLANIN 식으로 표현된다 동안 15 개 변수입니다. 실험은 적어도 일부 CD34 CD31 높은 순위 내피 세포는 림프 마커 PODOPLANIN (29)을 표현하는 것이 좋습니다 유동 세포 계측법. 인간의 림프 기형에 LYVE-1과 PODOPLANIN 염색의 체계적인 평가는 모두 LYVE-1 초기 림프에 강하게 존재하는 것으로보고, 정상 조직에서, 림프 기형의 내피 (30) 염색에 효과가 있음을 보여 주었다 있지만모세 혈관 내피 세포하지만 감소 수집 림프 내피 (31)도 존재. 우리의 목표는 분리이므로 모두 우리가 선택했다 초기 및 수집 림프 내피 세포는 우리의 셀 선택 전략의 일환으로 LYVE-1을 사용하지. 마지막으로, 이러한 마커를 사용하는 결정은 현미경 이미징 림프 혈관을 라벨에 대한 단적으로 사용되는 항체의 가용성, 유동 세포 계측법 및 면역 연구 사이의 상관 관계를 허용 할 기능을 기반으로했다. 이 문서는 포피와 림프 기형에서 CD34 낮은 CD31 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 수정체 상피의 성공적인 분리뿐만 아니라 CD34 높은 CD31 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 내피 세포에 필요한 조직 소화 방법, 세포 염색 및 FACS 설정을 설명합니다 조직.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

같은 차 림프 부종, 림프 기형 및 림프 종양과 같은 림프 시스템 장애는 상당한 사망률의 원인이 있지만, 거의가 자신의 생물학에 대해 알려진 드문 경우입니다. 질병과 건강한 조직에서 매우 순수한 인간의 림프 내피 세포 (수정체 상피)을 분리하는 것은, 유전 분자 및 세포 수준에서 림프 내피 세포의 연구를 촉진한다. 이들 연구는 이러한 조건의 임상 관리를 변경할 수 있습니다 새로운 치료법에 대한 목표를 공개 할 수 것으로 예상된다. 수정체 상피 및 림프 기형 림프 내피 세포 (LM 수정체 상피) 포피 인간의 고립을 설명하는 프로토콜이 표시됩니다. 획득하기 위해 단일 ​​세포 현탁액 조직 다진 및 효소 디스 파제 II 및 II 콜라겐을 사용하여 처리 하였다. 얻어진 단일 세포 현탁액을 분화 (CD) 마커 CD34, CD31, 혈관 내피 성장 인자 3 (VEGFR-3) 및 PODOPLANIN의 클러스터에 대한 항체로 표지 하였다. 스테인레스네드 가능한 세포는 다른 내피 세포 및 비 혈관 내피 세포에서 CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 PODOPLANIN 순위 LM LEC 인구를 분리하는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)에 분류되었다. 분류 LM 수정체 상피가 배양 및 추가 실험 사용 피브로넥틴 코팅 된 플라스크에 확대했다.

초기 티슈 소화 후, 분획 시료의 배양 24 시간 후, 별개의 내피 세포 콜로니 함께 섬유 아세포 유사 세포 및 평활근 세포 (도 2A)를 관찰 할 수있다. 다음 정렬 및 세포 배양에서 24 시간 후에, CD34 CD31 낮은 순위 VEGFR-3 순위 Podoplanin 순위 세포가 부착 전형적인 조약돌 형태 (그림 2B 및 C)를 보여줍니다. 상술 한 FACS 방법을 사용하여, 우리는 <...

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Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

isolation-human-lymphatic-endothelial-cells-multi-parameter

Research

JoVE Journal

Medicine

14.2K 조회수.  The Royal Children&#146;s Hospital.  이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다. 

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A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

암 세포에 의해 내피 세포 단층의 침략을 측정하는 실시간 전기 임피던스 기반 기술

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

연구

의학

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.