우리는 귀중한 전문 기술 지원 및 박사 Shivraj Tyagi에 대한 Emeka Ifedigbo 감사합니다. 우리는 또한 현미경 도움을위한 하버드 NeuroDiscovery 센터를 주셔서 감사합니다. 이 작품은 힐레어 램, 그리고 AMK 최에게 수여 NIH 보조금, R01 - HL60234, R01 - HL55330, R01 - HL079904에 부여 09PRE2250120 Predoctoral 미국 심장 협회가 일부 지원되었다.

전체 프로토콜은 동물의 조직, 세포 증식에​​ 대한 50-10일, 공기 - 액체 인터페이스에서 세포 차별 화를위한 추가 10-14일에서 세포 isolations 2 일 필요합니다. 추가 하루 세포 노출과 샘플 수확이 필요합니다. 1. 마우스 상피 세포 Tracheobronchial (MTEC)의 분리. 참고 : 모든 절차를 아래에서 설명을 검토한 결과, 브리검 앤드 위민스 병원 / 하버드 메디컬 스쿨 지역에있는 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 시작하기 전에 : <ul><li> 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어를 준비합니다. 250 ML 햄의 F12 기저 미디어 (Cellgro)는 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10 2 U/mL-10 2 MG / ML) 솔루션과 1000 X Fungizone 솔루션 250 μL의 2.50 ML를 추가합니다. 최대 4 주 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 0.15 %의 Pronase의 솔루션을 준비합니다. 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어 10 ML 15 MG의 Pronase를 추가합니다. 신선한 확인 및 사용 전까지 얼음 계속. </li><li> 깨끗한 작업 표면 살균 수술 악기 작은 동물 수술에 적합하고, 세포 isolations의 층상 조직 문화 후드를 준비합니다. 다른 모든 장비는 humidified CO 2 incubators, 추운 방, 탁상 세포 원심 분리기, 거꾸로 현미경, 그리고 일회용 플라스틱 피펫 문화 도자기를 포함한 동물 세포 배양을위한 표준으로 간주됩니다. </li><li> 콜라겐을 준비 I 솔루션 (0.02 N 아세트산에 50 μg / ML). 12 잘 트랜 스웰 플레이트 (코닝)의 각 우물에 피펫 1.0 ML의 콜라겐 솔루션입니다. parafilm에 싸서 실온에서 평평한 표면에 밤새 서 보자. </li></ul><ol><li> 상업에 사용할 마우스 변형 (남 6-8주 오래된 즉, C57Bl / 6)를 사용하여, 2 유도 마취법 같은 CO와 같은 안락사의 승인 방법을 사용하여 마우스를 안락사. 일반적으로 6 마우스는 씨앗 12 잘 트랜 스웰 플레이트를 충분한 세포를 (1.5-2.0 X 10 5 셀 / 마우스) 수율 것입니다. </li><li> 필드를 소독 70 % EtOH 솔루션과 동물 시체 스프레이. </li><li> 깨끗한 수술 가위와 메스로 tracheal 주위 피부를 제거하고, 기관을 폭로. 복부를 열고 가슴을 따라 잘라와 갈빗대를 제거합니다. 기관의 끝 부분이 노출 때까지 조직을 제거합니다. </li><li> 얼음에 항생제를 포함하는 30 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔 관에 플레이스 tracheas. </li><li> 멸균 층상 흐름 후드에서 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 멸균 100mm 페트리 접시에 tracheal 조직을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 무균 포셉, 외과 가위로 결합 조직을 해부하다. </li><li> 린스에 항생제를 포함한 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 새로운 100mm 페트리 접시에 tracheal 조직을 전송합니다. 루멘을 폭로 수직 축을 따라 tracheas 컷. </li><li> 10 ML 0.15 %의 Pronase 솔루션을 포함하는 50 ML 튜브에 tracheas을 전송하고 4 박 품어 ° C. </li><li> 두 번째 날에는 미리 준비하십시오 : <ul><li> DNAse I 솔루션을 준비합니다. 항생제는 -20 1 ML aliquots하고 저장하십시오 10 MG / ML 소 혈청 알부민 (BSA) 재고 솔루션 2 ML, 그리고 원유 췌장 DNAse I. 10 밀리그램을 추가 포함 햄의 F12 미디어 ° C 18 ML하려면 (에 해동 사용하기 전에 얼음). </li><li> 20% 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제가 들어있는 햄의 F12 미디어를 준비합니다. 200 ML 햄의 F12 기저 미디어 (Invitrogen)는 50 ML 열 inactivated FBS, 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10 2 U/mL-10 2 MG / ML) 솔루션, 그리고 1000 X Fungizone 솔루션 250 μL의 2.5 ML를 추가 . </li><li> 항생제를 포함하는 MTEC 기본 매체를 준비합니다. 위해 475.5 ML DMEM/F12 기본 미디어 (Cellgro)는 7.5 ML 1 M HEPES 솔루션, 200 MM의 글루타민 솔루션, 7.5 % NaHCO 3 솔루션, 100 X 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 5 ML 2 ML 10 ML, 500 μL를 추가 1000 X Fungizone 솔루션 </li><li> MTEC medium/10 % FBS를 준비합니다. 항생제를 포함하는 MTEC 기본 매체 45 ML하기 위해, 5 ML 열을 inactivated FBS를 추가합니다. </li></ul></li><li> 부드럽게 튜브 (1.8 단계에서) 10-12 번, 바위 그리고 그것이 4 30~60분에 대한 독립하자 ° C. </li><li> 튜브와 바위 12 회 20 % FBS와 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 추가합니다. </li><li> 20% FBS와 항생제를 포함하는 10 ML 햄의 F12 미디어를 포함하는 세 15 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. </li><li> 얼음이 솔루션을 별도로 설정 Pronase 솔루션에서 tracheas를 제거합니다. 햄의 F12를 포함하는 첫번째 원뿔 관에 tracheas을 전송하고 관에게 12 번 반전. 이 과정 두 번 더 반복합니다. </li><li> 한 50 ML 튜브로 단계 1.13에서 세 supernatants와 Pronase 솔루션을 결합합니다. 나머지 조직을 폐기하십시오. </li><li> 10 4 분 ° C, 그리고 뜨는 폐기를 위해, 1400rpm에서 원심 분리기 (A - 4-62 로터가 장착된 Eppendorf 5810R의 원심 분리기 390 XG). </li><li> 부드럽게 한 ML DNAse 솔루션에서 펠렛을 (100-200 μL / 기관) resuspend얼음에 5 분 알을 품다. </li><li> 5 4 분 ° C, 그리고 뜨는 폐기에 대한 1400rpm (390 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 10% FBS를 포함하는 8 ML MTEC 매체에있는 세포 펠릿을 Resuspend </li><li> Primaria 판에 플레이트 세포 현탁액 (팔콘). 37 품어 ° 95 %의 공기 분위기에서 C, 5 시간 (주 : 이것은 섬유아 세포에 대한 부정적인 선택 단계)에 대한 5 % CO 2. </li><li> 접시의 세포 현탁액을 모아서 4 ML MTEC 10 % FBS를 포함하는 두 접시와 린스. 풀 세포 현탁액하고 50 ML 원뿔 관에 함께 씻는다. </li><li> cytospin과 셀 카운팅 1 ML을 보존. 5,000 RPM (Eppendorf 5415D)에서 5 분 탁상 원심 분리기의 회전. 나머지 뜨는 500 μL와 re​​suspend 펠렛을 제거합니다. Trypan 블루 중요한 염색법의 방법을 사용하여 셀 카운팅 100 μL를 사용합니다. cytospin 분석 100 μL 4 aliquots을 절약 </li><li> 4, 1400rpm (390 XG)에서 나머지 15 ML의 세포 현탁액을 스핀 ° C, 10 분. </li></ol> 2. 에어 리퀴드 인터페이스에서 전파 및 MTEC의 분화 retinoic 산 주식 솔루션을 준비합니다. 증권 솔루션 A : 95 % EtOH에 5 MM 주식 솔루션을 만들기 위해 어둠 속에서 Retinoic 산성 (미스터 300.44 g / 몰)을 나가는거야. -80에서 호일 포장 튜브에 저장 ° C. 필요에 따라, 50 μL 증권에게, 500 μL BSA 솔루션 (100 MG / ML)와 49.5 ML 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)을 추가하여 재고 솔루션 B를 (5 μm의) 준비합니다. 호일에 저장소가 최대 4 주 동안 -80 ° C에서 튜브를 감쌌다. retinoic 산성을 포함하는 MTEC 확산 매체를 준비합니다. 항생제를 포함하는 45.7 ML MTEC 기저 미디어로, 2.5 ML 열 - inactivated FBS, 1 ML Retinoic 산 주식 B, 250 μL 인슐린 솔루션 (4 MM HCL 2 MG / ML의 인슐린), 250 μL 표피 성장 인자 솔루션 (/ 5 μg을 추가 1 MG / ML BSA가 들어있는 HBS의 ML EGF), 200 μL 소 뇌하수체 추출 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 15 MG / ML), 50 μL 트랜스페린 솔루션 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 5 MG / ML 트랜스페린 ), 50 μL 콜레라 독소 솔루션 (HBS 1 MG / ML BSA를 포함한 100 MG / ML). 최종 미디어 준비를 소독 필터와 준비 2 일 이내에 사용합니다. <ol><li> 트랜 스웰 플레이트에서 콜라겐 솔루션을 제거, 5 분 후드 아래에 서서하게하고, PBS로 2 회 씻는다. </li><li> 다음 원심 분리는 물론 당 7.5 X 10 4 -1.0 X10 5 세포의 도금을 촉진하는 확산 미디어 (500 μL)의 적절한 볼륨에있는 세포 펠렛을 resuspend. 트랜 스웰 폴리 카보 네이트 막 삽입의 혀끝의 표면에 피펫 500 μL 세포 현탁액. 트랜 스웰의 기초 구획으로 확산 미디어 1.5 ML를 추가합니다. </li><li> 37 빠져들 MTEC 문화를 품어 ° 95 % 공기가 들어있는 humidified 인큐베이터에서 C, 7-10 일 동안 5 % CO 2. </li><li> 미디어에게 처음을 변경하기 전에 3 일 기다려. 매일 미디어를 변경합니다. 전극 (EVOM Ohmvoltometer, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다)를 사용 transepithelial 세포 저항의 육안 검사 및 측정에 의해 문화를 모니터링합니다. </li><li> 세포가 합류 나타나고 상피 저항 1000 Ω / cm 2에 도달하면, 세포가 ALI에서 차별화하는 준비가되어 있습니다. </li><li> 2 % NuSerum을 포함 MTEC 기저 미디어를 준비합니다. 2퍼센트 V / V.의 최종 농도 MTEC 기본 매체 NuSerum 추가 사용하기 전에 1 X 10 -7 M의 최종 농도 retinoic 산성 주식 B를 추가합니다. 신선한 준비 2 일 이내에 사용합니다. </li><li> 세포 꼭대기의 미디어를 제거하고 2% Nuserum 및 retinoic 산성을 포함하는 750 μL MTEC 기초 매체와 기저 미디어를 대체하여, 10-14 일 동안 차별을 허용합니다. 기초 미디어를 변경하고 MTEC는 매일 2 % NuSerum를 포함하는으로 혀끝의 측면을 씻으십시오. </li></ol> 3. 교양 상피 세포에 담배 연기의 응용 <ol><li> CS 셀 노출 시스템 (EMI 인 스트 루먼트, 피츠버그, PA)를 사용하는 주류 담배 연기에 트랜 스웰 문화의 혀끝의 측면을 폭로. 장치의 사진을 위해 그림 1을 참조하십시오. 기술 사양 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오. 간단히 기기는 통풍 노출 챔버에 연결된 폴리 프로필렌 라인에 주류 연기 그리기 ~ 7-8 퍼프 각 담배를 피우는 연동 펌프로 구성되어 있습니다. 노출 챔버는 물을 순환하여 ° 37 C를 유지하고, 가스 라인 5 % CO 2 분위기에서 관리하고 있습니다. 세포는 켄터키 3R4F 연구 참조 필터 담배 (담배 연구소, 켄터키 대학, 렉싱턴, KY)를 사용하여 연기에 노출 될 수 있습니다. 일반적으로 세포는 총 미립 물질 (TPM)의 100-200 밀리그램 / m 3을 항복, 1-2 담배 연기에 노출되어 있습니다. 컨트롤 문화가 동등한 노출 기간 동안 실내 공기에 노출되어 있습니다. </li><li> TPM은 TE와 함께 제공된 제조 업체의 프로토콜에 따라 측정됩니다- 10C 흡연 기계 (티그 기업). 간단히, 필터 (Pallflex)은 지속적인 흐름 펌프 (샘플링 단위)로 연기 챔버의 샘플링 포트에서 선도적인 샘플링 튜브에 인라인 스테인레스 스틸 홀더에 배치됩니다. 유출 관은 가스 미터 (건식 가스 미터, ONM61, 67, AEM)로 샘플링 장치를 연결합니다. 필터는 가스 샘플링 전후 무게입니다. 전체 자료 MG의 필터에 예금이 샘플 공기의 총 볼륨의 정상화이다. </li><li> 세포는 다음 어느 시점 (즉, 0-24 시간) 게시물 표준 셀 분석 절차에 대한 노출 (즉, 서양 immunoblot 분석, mRNA 분석, 등) 또는 현미경 (즉, 공촛점 또는 전자 현미경)에서 수확한 수 있습니다. 문화 미디어는 또한 크린 시토킨 또는 세포 독성의 assays에 대한 LDH 릴리스에 대한 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 ALI에서 성공 상피 분리, 증식, 그리고 차별화는 조약돌 형태로 그대로 monolayer를 얻을 것입니다. 건강 문화 Transepithelilal 세포 저항은 약 1000년부터 2000년까지 Ω / cm 2되어야합니다. 그림 2는 제어 조건과 담배 연기에 노출된 후 상피 세포와 솜털 표시에 대한 스테인드 마우스 호흡기 상피 세포 monolayer을 묘사. 그림 3은 ultrastructure와 속눈썹의 형태를 묘사, 건강 MTEC 문화의 대표적인 전자 micrographs를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 세 단계, 격리 단계, 전파 단계, 공기 - 액체 인터페이스 (구조)에서 차별화 무대를 통해 상피 세포의 진행의 준비. 상피 세포들은 가라 앉 문화 분아 따위에 의해 번식 transwells에 씨앗을 마우스 기관에서 고립, 그리고 그들이 완전히 차별화하는 공기 - 액체 인터페이스로 변환됩니다. 실험은 일반적으로 지속적인 문화의 24 일 당일에 실시하고 있습니다. 사진은 주류 담배 연기에 교양 세포의 노출을위한 모델 시스템을 묘사. 트랜 스웰 알리 문화 시스템은 온도, 습도 및 CO 2를위한 제어하는 사용자 정의 모듈 담배 연기 전달 시스템 내부에 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 상피 세포 문화는 고정 및 스테인드 핵에 대한 (Hoechst 33258), F - 굴지 (녹색, 알렉사 - 플루어 488 - 복합 Phalloidin)되었습니다. 그리고 속눈썹 마커 acetylated α - tubulin (빨간색, Cy3 - 복합 이차 항체). 하단 패널 4 시간 담배 연기 (2 담배, 150 MG / m 3)에 노출 후 촬영 상피 세포의 동일한 이미지를 보여줍니다. (B) 락트 산 탈수소 효소 (LDH) 출시 24 시간으로 표시 담배 연기의 다양한 복용에 노출된 후 기저 매체 측정되었다. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 마우스 tracheal 상피로부터 분리된 상피 세포의 공기 - 액체 인터페이스 문화는 전송 전자 현미경에 의해 (TEM) 솜털이있는, 기초, 비 솜털이있는 세포 1의 특성을 몇 가지 subtypes의 구별. 이러한 세포는 pseudostratified 호흡 상피를 typify. 그림 레이블에 해당하는 : BB : 기초 신체, : axoneme, M : mitochondria, N : 핵, S : 기판 (폴리 카보 네이트 막), MV : microvili

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

마우스 tracheal 상피 세포의 격리를 나타내는 프로토콜 1. 당신이 외의 프로토콜에서 적응하고, 다른 수정 2-3. 것입니다 어떤 프로토콜 설명 셀 isolations와 마찬가지로 가장 중요한 부분은 엄격한 무균 기술을 사용하여 세균이나 곰팡이 병원균의 오염을 방지하는 것입니다. 두 번째 중요한 단계는 fibroblast의 tracheas주의 절개로 피할 수있는 문화의 오염, 그리고 1.19 단계?...

* 흡연 기계는 맞춤 설계 및 가공 14 &quot;x14&quot;x20 &quot;이중 chambered 물을 외피 가벼운 틴트 확실하게 증명 1 / 2&quot;온도 조절, 수위 센서와 함께 담배 연기 노출을위한 두꺼운 폴리 카보 네이트 Lexan 챔버 시스템을 차단 제어됩니다. 단위 퍼핑 / 금연 담배가 속도를 피고 변수 담배 설치됩니다. 장치가 사용되면, 그것은 온도, 습도 및 이산화탄소가 시스템으로 제어되는 의미에서 보육을 모방한 것이었 지요. 시스템이 포함되어 있습니다 (I) 조직 배양 실험을위한 통제된 환경을 유지 맞춤형 듀얼 챔버 / 물 외피 단위. (II) 디지털 헤비 듀티, 수위 센서 및 온도 제어 펌프를 피고로 (III) 흡연 단위로 고정밀 이중 펌프 물 온도 순환 장치 시스템입니다. 인라인 (IV) 펌프 사이클 센서 제어 속도 자전거 타는 사람 (IV) 스테인레스 스틸 고정밀 필터 홀더. (V) 분리 뚜껑은을 위해 괄호와 함께 2분의 11 &quot;크기의 축 균일의 담배 연기 혼합 팬. (VI) 물의 순환 장치 장착 브래킷과 중간 크기의 물 목욕. (VII) A 1 / 2 &#39;두께 플렉시 글라스 트레이 장착 담배 가루 수집기 낸 펌프 및 홀더. 설명한대로이 기계는 그러한 TSE 시스템 (에서 제공하는 종류와 유사한 상용 - 흡연 가능한 기계로 대체 수 있습니다 <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse - systems.com</a> ).

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

폐 상피 세포는 호흡 생쥐의 넓이와 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)에서 양식에서 격리 수 있습니다. 프로토콜은 CS에 노출되는 상피 세포의 반응을 연구하기 위해 주류 담배 연기 (CS) 이러한 세포를 분리하고 노출에 대해 설명합니다. 마우스 기관, 공기 - 액체 인터페이스 (ALI)로 완벽하게 차별화된 상피 세포에서 이러한 세포의 culturing, 문화에서 이러한 세포 보정 주류 CS의 배달에서기도 상피 세포의 분리 : 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다. 알리 문화 시스템은보다 밀접하게 일반 액체 문화 시스템보다 생리 설정을 닮은 그 조건 하에서 호흡기 상피 조직의 문화 수 있습니다. CS 노출하는 분자 및 폐 세포 반응의 연구는 인간의 건강에 대한 환경 대기 오염의 영향을 이해의 중요한 구성 요소입니다. 이 분야에서 연구 결과는 궁극적으로 만성 폐쇄 폐 질환 (COPD), 주요 글로벌 건강 문제를 나타내는 다른 담배 관련 질병의 병인을 이해하는 방향으로 기여할 수 있습니다.

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

폐 상피 세포는 생쥐의 호흡기로부터 격리하고 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스에서 교양 수 있습니다. 프로토콜이 환경 독소에 분자 반응을 연구하기 위해, culturing를 분리하고 주류 담배 연기 이러한 세포를 노출에 대해 설명합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

33.8K 조회수.  Harvard Medical School. 폐 상피 세포는 생쥐의 호흡기로부터 격리하고 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스에서 교양 수 있습니다. 프로토콜이 환경 독소에 분자 반응을 연구하기 위해, culturing를 분리하고 주류 담배 연기 이러한 세포를 노출에 대해 설명합니다.

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

실험 인간 폐렴의 운송

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

연구

의학

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

전자 담배와 담배 연기의 효과 비교<em&gt; In Vivo</em&gt; 노출 시스템

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

공기-액체 인터페이스에서 재배된 인간 폐 세포를 노출하여 공기 중 입자의 급성 흡입 독성 평가

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.