Name: a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion
Uploaded: 2015-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
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The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. 다른 미디어와 추가 구성 요소를 준비 <ol><li> 실험에 앞서, 테스트 할 중 정상 FBS를 첨가, 숯 제거 FBS, 또는 숯을 박탈 FBS 플러스 요소와 DMEM 또는 지정된 다른 매체로 구성된 미디어를 준비합니다. 여러 구성 요소가 각각의 실험에서 테스트 할 수 있습니다. </li><li> 칭량 적절 생리적 농도 목탄 스트립 혈청 중에 용해되는 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는 희석. </li></ol> 2. 얼음에 콜라겐 매트릭스를 준비합니다 <ol><li> 200 μL의 10 배 PBS (PH 7.4), 5.4 ㎕의 1 N NaOH를 두 번 증류 H 2 O의 600 μL, 1.2 ml의 콜라겐 I : I는 얼음에 다음 멸균 여과 구성 요소를 추가하여 2.2 ㎎ / ㎖에서 매트릭스 2 ml의 콜라겐을 준비 AT (3.63 ㎎ / ㎖). </li><li> 판 할 준비가 될 때까지 얼음에 콜라겐 I 솔루션을 유지합니다. </li></ol> 3. &lt;분석에 대한 마이그레이션 / 침략 플레이트를 준비/ P&gt; <ol><li> 각 세포주가 시험 될 들어 12- 웰 인서트를 포함하는 24 개 웰 플레이트 챔버를 사용한다. 화학 유인 물질 미디어를 추가하고 실험 세트까지의 삽입을 전송하기 위해 삽입을 포함하지 않는 추가 12 우물을 사용합니다. 주 : 세포주 여기 용도 폴리에틸렌 텔레 프탈레이트 (PET) 멤브레인 및 8 ㎛의 공경 플레이트 콜라겐 매트릭스가 최적이다. 단, 프리 코트 번호판 마트 리겔 매트릭스는 세포주가 조사되고 감소에 따른 기공 크기로 치환 할 수있다. </li><li> 분명히 (제어, 비 침습적 세포주에 대한 FBS 마이그레이션, CS-FBS 마이그레이션, FBS 침공하고, CS-FBS의 침략뿐만 아니라 FBS 이주) 분석되는 조건 당 3 우물을 사용하여 판 레이블을 지정합니다. 콜라겐이나 마트 리겔 매트릭스를 통해 다음 막에 구멍을 통해 이동하여 PET 막에 구멍을 통해 이동하고, 분석의 침략에 의해 분석 마이그레이션. 각 셀 조건에 대해 다른 색 마커를 사용하여도금 프로세스 ID. </li></ol> 4. 침략 매트릭스를 분배 <ol><li> 조심스럽게 인서트로 콜라겐 기질 용액 75 μL 침윤 분석에 사용되는 피펫. 거품을 피하기 위해주의해야합니다. 표면에 반전 된 피펫 팁을 적용함으로써 기포를 분산. </li><li> 고화 겔 있도록 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에 콜라겐 코팅 된 플레이트 인서트를 전송합니다. </li></ol> 5. 접시 막 또는 침략 매트릭스 위에 셀 <ol><li> 한편,를 Trypsinize 세포와 10 % FBS와 미디어를 추가 할 수 있습니다. 스핀 세포 테이블 상단 원심 분리기에 5 분 200 XG에 혈청이없는 배지에서 배를 씻어. </li><li> 무 혈청 배지에서 재현 탁. 혈구 또는 자동 슬라이드 카운터 세포를 계산합니다. 5 × 104 세포 / ml의 최종 농도를 혈청이없는 배지를 추가한다. </li><li> 콜라겐 매트릭스가 (30 분 후) 고체화되면, 매체로의 700 μl를 추가하거나2 % 정의 된 FBS 또는 각 웰에 FBS를 숯 - 제거. 접시 당 12 인서트 : <ul><li> 3 인서트는 미디어와 콜라겐과 우물이 + 2 % FBS </li><li> 3 인서트는 미디어와 콜라겐과 우물이 + 2 % CS-FBS </li><li> 3 삽입 미디어 + 2 % FBS와의 콜라겐과 우물이 없습니다 </li><li> 3 인서트는 미디어와의 콜라겐과 우물이 없습니다 + 2 % CS-FBS </li></ul><ol><li> 테스트되는 요소의 수와 각 조건에 대응 없음 콜라겐 따라 추가 제어 플레이트를 사용한다. </li></ol></li><li> 모든 마이그레이션 및 침략 삽입에 삽입 당 500 ㎕의 세포를 도금, 5 × 10 4 세포 / ml의 삽입에 세포 현탁액을 추가합니다. </li><li> 37 ° C에서 22 시간 동안 세포를 품어. </li></ol> 6. 마이그레이션 및 침입하는 세포의 수를 정량화 <ol><li> 별도의 우물에서 메탄올 정착, 에오신 및 hemotoxylin를 사용하여 우물의 설정 염색. </li><li> 각 우물에서 세포와 매트릭스를 제거하기 위해 면봉을 사용합니다.각 웰에 대한 두 번째 면봉 응용 프로그램과 함께 Rrepeat. </li><li> 집게로, 연속 3 각 솔루션에 각 삽입 1 초 동안 5 번 찍어. </li><li> 인서트 / N을 O를 건조하도록 허용합니다. </li><li> 어느 I) 가장자리 주위에 조심스럽게 절단, 메스 필터를 제거하고 커버 슬립과 침수 오일 슬라이드에 장착, 또는 ⅱ) 인서트 O / N 반전 건조 현미경 직접 삽입을 사용할 수 있습니다. </li><li> 다음 날, 20 배의 목적으로 현미경 슬라이드 또는 삽입을 확인하고 필터의 다른 지역에서 5 이미지를 가져 가라. 일관성을 개선하기 위해 4 외부 필드와 하나의 중심을. </li><li> ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 모든 조건에 대한 세포를 계산하고 아래 공식에 적용됩니다. </li><li> 다음과 같이 %의 침공을 결정 : 나는 = 삽입 콜라겐을 통해 침입 세포의 # 평균 제어 삽입을 통해 마이그레이션 세포의 # = B 평균 %의 침략 = (A / B) * 100 </li><li> 다음과 같이 2 % FBS의 침략 지수를 결정 세포의 %의 침공 (2 % FBS에서) 분석되고 = C % (2 % FBS)의 제어 비 침습적 세포의 침윤 = D 내습 지수 (FBS) = (c / d) </li><li> 다음과 같이 2 % CS-FBS의 침략 지수를 결정 세포의 %의 침공 = E (2 % CS-FBS에서) 분석되고 %의 (2 % CS-FBS)에서 제어 비 침습적 세포의 침윤 = F 내습 지수 (CS-FBS) = (E / F) </li></ol> 7. 실험 프로토콜 +는 X N 여러 요인이 결합하여 숯불 제거 FBS에 FBS를 숯불 제거 비교 <ol><li> &quot;X&quot;또는 구성 요소의 조합에 대해 서로 다른 구성 요소를 사용하여 필요에 따라 절차를 여러 번 반복합니다. </li><li> 마이그레이션 및 침략 효과에 대한 각 요인 &quot;X&quot;의 기여를 결정하기 위해 계산을 적용합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

종양의 전이는 다단계 과정이다. 세포 기저막을 뚫고 그들이 원위부로 이송되는 림프계 또는 혈액 중 미세 혈관 내로 intravasate한다. 종양 세포를 extravasate 및 12에 정착하는 macrometastasis. 중간 엽 전이 (EMT), 종양의 침윤과 전이에 상피를 통해 진행이 스테로이드 호르몬 13, 14로 향상되었습니다, 성장은 15 ~ 18, 사이토 카인 19-21 요인. 이들 분자는 분석의 발전은 종양 ?...

신규 침윤 분석은 특정한 호르몬, 암세포의 침윤 등의 화학 유인 물질 사이토킨 및 / 또는 성장 인자의 참여를 식별하기위한 목적으로 개발되었다. 세포 외 기질 (ECM)를 통해 침투하는 종양 세포의 능력은 전이성 표현형 1-3의 특징이다. 침략 챔버 광범위하게 암 세포 침윤 및 이동을 연구하기 위해 체외 도구로 사용되었고, 생체 내 종양 침윤과 전이의 메커니즘에 관한 지식을 제공 할 수있다. 챔버는 세포 배양 플레이트의 웰 내에 중첩 원통형 세포 배양 용 인서트로 구성된다. 인서트 하의 정의 기공 크기의 반 - 투과성 폴리 카보네이트 나 폴리스티렌 막이다. 표준 침공 분석에서, 세포는 혈청 무료 미디어를 삽입 막에 접종하고 혈청 또는 혈청과 같은 화학 유인 물질로 가득 세포 배양 우물에 배치 s의등 최대 chemoattractive 힘. 이 힘 드라이브의 세포를 검출하고 세포 수를 정량화하는 종래의 염료를 사용하여 염색 할 수있는 세포 외 기질 (침입)의 코팅을 통해 대안 반투막 (마이그레이션)을 통해 이동하거나한다. 세포 수는 다음 비 침습적 세포주의 이동과 침략의 정도에 따라 정규화된다. 이 방법은 연구자가 유전자 조작을 포함한 조건, 다양한에서 다른 세포 유형의 침략 가능성을 평가할 수 있습니다. 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자는 혈청의 중요한 구성 요소이다 점점 침습적 표현형 4 구동과 연관되는 것으로 도시되고있다. 그러나, 여전히 침략을 매개 이러한 chemoattractive 혈청 분자의 성격, 역할, 특이도는 애매 남아있다. 문제는 운전에 대한 책임이 있습니다 혈청 또는 혈청과 같은 화학 유인 물질의 특정 요인이 무엇인지 결정하기 위해 남아분자가 침입 과정을 억제 할 수 어떤 암세포 침윤뿐만 아니라. 이 보고서에서, 우리는 암세포의 침윤 및 chemoattraction 구동 분자로서, 호르몬, 사이토 카인 및 / 또는 혈청에 존재하는 성장 인자의 잠재적 개입을 평가하는 방법을 설명한다. 제안 된 프로토콜의 변형 된 목탄 스트립 핑은 2 % 목탄 스트립 FBS (CS-FBS)을 생성하기 위해 2 % 소 태아 혈청 (FBS)에서 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자를 제거하는 데 사용된다. 2 % FBS와 2 % CS-FBS 모두 암 세포 침공을 구동 chemoattractive 힘을 설정하는 에이전트로 사용됩니다. 통상 2 % FBS와 비교 chemoattractive 제로서 2 % CS-FBS를 사용하여 제 등 여러 가지 이점을 수득하고, 가장 두드러지게, 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자의 감소 / 상대 부재 하에서 암 침윤 표현형을 연구 할 수있는 능력. 또한, 호르몬, 성장 인자 집단 제거 여부를 평가하기 조사자 가능하며, CYtokines은 침략 지수의 증가 또는 감소가 발생합니다. 분석 후, (도 2 및 3 참조) &quot;X&quot;로 표시된 각각의 성분의 첨가는, 감소, 증가를 억제하거나, 원래 값으로 침습적 인덱스를 복원 할 수 있는지 여부를 결정하도록 설계된다. 이 방법론은 목탄 스트립 핑 동안 혈청으로부터 제거 성분의 생리 학적 수준을 달성하기위한 구체적인이지만, 또한 목탄 스트립 핑은 또한 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있음을 유의해야한다. 예를 들면, 목탄 스트리핑 osteoprogenitor 세포의 알칼리성 포스파타제 활성을 감소 및 MAPK의 활성화 제 (5)의 환원을 통해 지방 형성을 유도 할 수 있다고보고되었다. 숯 박탈 미디어 시판하고 그 프로토콜에 따른 덱스 트란이 숯불을 겸비한 소 태아 혈청 O / N 항온 6 나와있다. 이 분석은 RESPO 개발되었다NSE는 주커 등. (7)에 의해보고 된 결과에 저자는 보통 2 % FBS와 미디어를 향해 마이그레이션 할 때 간극 결합 통신에 영향을 미치는 돌연변이 표현형 침공 지수의 증가를 보여 것을 보여 주었다. 이 증가는 숯불 제거 혈청의 교체와 함께 탈락했다. 이 결과에서, 저자들은 결론 지었다 친 유성 분자 향해 돌연변이의 영향이 이주 (구체적으로, 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는) 7. 이곳은 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 및 종양 촉진 및 내습 4에 관련된 신호 전달 경로 매개하는 것으로 알려져있다. 따라서, 과학 연구자가 어떤 요인 (들)이 연구에서 자신의 특정 암 세포 또는 돌연변이 종양 침략을 주도하고 결정하는 것이 중요하다. 성분의 농도 차이에 따라 결정되는 바와 같이 분석은 생리 학적 농도에서의 개별 성분의 역할을 충족하도록 설계 및# 8220; X &quot;정상 FBS와 CS-FBS에서. 이 분석의 개발을 통해, 연구자들은 자신의 시스템에 적용되는 특정 침입 경로에 더 많은 통찰력을 얻을 수 있습니다. 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인은 종종 종양 촉진제 (8)으로 분류되어왔다. 이러한 EGF 이러한 요인 중 일부는 침략 챔버 9 화학 유인 물질에 대한 직접 소스로 사용된다. 따라서, 이러한 직접 종양 침윤이 혈청의 주요 구성 요소를 나타내는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 조사자가 암세포의 잠재적 침입을 매개 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인의 참여를 평가할 수 종래 내습 시험 관내 분석에 간단하면서도 중요한, 변경을 제안한다. 그러나, 분석은 귀중한 시간 및 R을 사용하지 않도록, 절차는 초기 분석 단계에서 그들의 연구에 효과적인 것인지에 대답 사관을 제공하도록 설계esources 불필요한 것으로 간주합니다. 이 방법은 CS-FBS를 사용하고 잠재적으로 암 세포 침공을 중재 리드 후보로 추구하는 분자있는 상태로 연구자의 판단에 의존한다. 이들 분석의 결과는 혈청 성분이 특정 세포주 또는 돌연변이에 대한 화학 유인 물질 또는 억제제가 연구되고있는 역할을 식별하는 데 유용하다는 것을 증명한다. 또한,이 방법은 조사 홍보 또는 암 세포 침윤을 억제하거나 키 신호 전달 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다; 따라서 미래의 약물 디자인을 연출.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts with 8.0 &amp;micro;m PET membrane</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td></tr><tr><td>Fixative; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr></tbody></table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

혈청 암세포 미세 혈관에 자신 intravasation 용이 마이그레이션 침입하는쪽으로 화학 유인로서 기능한다. 그러나, 세포가 이동하는 방향으로 실제 분자는 애매 남아있다. 이 변형 침윤 분석은 세포 이동 및 침입을 구동 대상을 식별하기 위해 개발되었다. 이 기술은 특정 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는 암세포의 잠재적 침입을 매개하는 역할을한다 여부를 확인하는 세 조건 하에서 내습 인덱스를 비교한다. 이러한 조건은 ⅰ) 정상 소 태아 혈청 (FBS)이, ⅱ) 숯 막았 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 및 ⅲ) CS-FBS + 분자를 제거 FBS (CS-FBS가), ( &quot;X&quot;)를 표시 포함한다. FBS 비교하여 CS-FBS와 세포 침윤에 큰 변화는 변화를 매개 호르몬, 사이토 카인 또는 성장 인자의 관여를 나타낸다. 개별 분자는 다시 자신의 능력을 분석하기 위해 CS-FBS에 다시 추가 될 수있다부르면 또는 침략 표현형을 구출. 또한, 두 개 이상의 요소가 구동 또는 첨가제 또는 침입을 억제하는 다수의 분자의 상승 효과를 평가하기 위해 결합 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 호르몬, 사이토 카인, 및 / 또는 성장 인자가 암세포의 특정 형식 또는 특정 돌연변이에 대한 화학 유인 물질 또는 침입의 억제제로서 작용하여 세포의 침윤에서 역할을 수행할지 여부를 결정하는 조사원을 가능하게한다. 특정 화학 유인 물질 및 억제제를 확인함으로써,이 수정 침공 분석은 암 세포 침공을 지시 신호 전달 경로 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

내습 인덱스는 비 침습적 세포주 정규화에 따라 각 조건에 대해 계산된다. 실험을 위해, 우리는 1205Lu 흑색 종 세포주 설립 변이체 안정한 세포주 우리 침습 선으로뿐만 아니라 1205Lu 셀들은 논리적 제어 역할 10 유도되었던 암성 비침 변이체 WM793를 사용한다. 즉 진피의 주성분이기 때문에 또한 내습 행렬로서 콜라겐 I를 이용한다. 최적 내습 행렬 세포주에 기초하여 생체와의 일치의 ...

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A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

수정<em&gt; 시험관</em&gt; 침공 분석은 호르몬, 중재 암 세포 침략의 사이토 카인 및 / 또는 성장 인자의 잠재적 인 역할을 확인하는

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

10.7K 조회수.  Roswell Park Cancer Institute. This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

비디오: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

연구

암 연구학

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

의학

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

유전학

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

암 생물학의 3D 모델: 헤테로스페로이드의 침입 역학

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

저자 스포트라이트: 두경부암 진행 중 암과 면역 세포 사이의 누화 해독

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

테스트를위한 병아리 심장 침략 분석 암 세포의 침윤과 잠재적 안티 침략 화합물의 활동

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

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TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

실시간으로 중피 세포의 난소 암 회전 타원체의 부착과 침략의 평가

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

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