박테리아에서 세포 분열 단백질의 역학에 대한 연구는 세포의 공간적 방향을 필요로합니다. 예를 들어, 박테리아 세포 분열의 주성분인 Z-링의 경우 수직 방향은 XY 평면의 전체 구조를 기록하는 데 기본입니다. 이 비디오에서 우리는 필라멘트 시아노박테리아 Anabaena에서 이러한 특정 방향을 달성하는 방법을 개발합니다.
Anabaena는 다세포 광합성 유기체이며 대기 중 이질소를 질소 공급원으로 사용하는 능력을 다른 박테리아와 공유합니다. 이 요소가 없으면 Anabaena는 질소 고정에 특화된 세포를 분화시킵니다. 따라서 세포 분열과 다세포 사이의 관계를 분석할 수 있는 우수한 모델을 제공합니다.
먼저, 표적 사상 시아노박테리아 균주에 존재하는 점유리 성분을 선택합니다. 실험을 위해서는 형광 단백질에 융합된 선택된 점쟁이 성분을 발현하는 필라멘트 시아노박테리아 돌연변이체를 구성할 필요가 있습니다. 이 프로토콜에서는 GFP에 융합된 FtsZ를 발현하는 Anabaena 돌연변이를 예로 사용합니다.
먼저, 고정상에서 10 밀리리터의 배양 물과 90 밀리리터의 액체 배지로 돌연변이의 신선한 계대 배양을 만듭니다. 그런 다음 지수 단계에 도달할 때까지 일정한 빛과 최적의 온도에서 새로운 세포 배양을 성장시킵니다. 이 예에서 돌연변이는 섭씨 25도에서 7일 동안 성장했습니다.
이제 성장 배양 물 2 밀리리터를 원심 분리기 튜브에 넣으십시오. 실온에서 10 분 동안 2, 500 x g에서 원심 분리한다. 원심분리 후 모든 셀이 튜브 바닥에 있는지 확인하십시오.
s를 취급하는 동안 주의하십시오.amp재가 중단되지 않도록 합니다. 3% 저융점 아가로스 용액을 전자레인지에 가열합니다. 짧은 시간 간격으로이 작업을 수행하고 완전히 액체 상태가 될 때까지 용액을 확인하는 것이 중요합니다.
녹으면 식히기 위해 따로 보관하십시오. 이전 단계의 원심분리기 튜브를 취하여 상청액 1.9밀리리터를 버리고 위아래로 최소 3회 피펫팅하여 나머지 부피의 세포를 다시 현탁합니다. 작업장에서 세포가 들어있는 튜브, 녹은 아가로스 용액, 팁에 잘린 1 밀리리터 주사기 및 새롭고 깨끗한 칼날이 달린 메스를 넣으십시오.
이어서, 세포를 900 마이크로리터의 3%아가로스 용액과 적어도 3회 피펫팅하여 혼합한다. agarose 용액이 너무 뜨겁지 않고 액체로 남아 있는지 확인하는 것이 정말 중요합니다. 이를 통해 우리는 이 과정에서 세포 손상을 방지하고 있습니다.
다음 단계는 아가로스 용액이 겔화되기 전에 신속하게 수행되어야합니다. 1 밀리리터 주사기에서 agarose 매트릭스를 조심스럽게 빨아들입니다. 샘플이 빨려 들어가는 동안 기포가 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다.
그 후, 샘플을 배양하고, 주사기를 실온에서 2 시간 동안 수평 위치에 놓는다. 배양 후 깨끗하고 평평한 표면에서 플런저를 사용하여 세포가 있는 매트릭스를 조심스럽게 제거합니다. 메스를 사용하여 겔 샘플을 가능한 한 얇게 조각하여 매트릭스의 무결성을 유지합니다.
그런 다음 샘플을 해당 커버슬립에 나란히 놓습니다. 비디오에서 볼 수 있듯이 이 단계에서는 팁을 사용하여 샘플 처리 프로세스를 지원할 수 있습니다. 타임랩스 실험의 경우 현미경 분석을 위해 만들어진 세포 챔버를 사용하는 것이 좋습니다.
이 경우 비디오에서 볼 수 있듯이 이러한 유형의 챔버에 맞는 원형 커버 슬립을 사용합니다. 마지막으로, 샘플의 탈수를 방지하기 위해 챔버 내부에 용융된 3% 아가로스 용액을 추가합니다. 이미징하기 전에 아가로스가 완전히 겔화 될 때까지 기다리십시오.
이제 이미징을 위해 현미경에 세포가 있는 챔버를 넣습니다. 온도 및 습도 조절이 가능한 장비를 사용하는 것이 좋습니다. 최대 배율로 명시야에서 샘플을 시각화하고 수직 방향의 필라멘트를 검색합니다.
Z 평면을 따라 자가형광 신호를 사용하는 초기 스캔으로 관심 분할 부위를 찾을 수 있습니다. 이를 통해 형광 단백질 마커의 파라미터를 사용하여 분열 부위에서 관심 단백질의 신호를 시각화할 수 있습니다. 이제 생물학적 모델과 관심 단백질에 따라 타임랩스 실험을 수행할 수 있습니다.
이 경우 XY 평면에서 FtsZ-GFP 돌연변이에서 Z-링의 전체 구조를 볼 수 있습니다. 우리의 방법으로, 우리는 오랜 시간 동안이 고리의 역학을 기록 할 수있었습니다. 마지막으로, 형광 강도의 변화와 함께, 우리는 이 구조가 우리 모델에서 매우 역동적이라는 결론을 내립니다.
이 방법은 Anabaena를 모델로 사용하여 필라멘트 시아노박테리아와 같은 복잡한 형태에 적용된 컨포칼 현미경을 통해 분열 부위의 단백질 역학을 등록하는 빠르고 저렴한 프로토콜입니다.
