이 프로토콜은 살아있는 세포에 있는 미토콘드리아 핵의 특정 표시및 고해상도에 그들의 운동의 정량적인 연구를 허용합니다. 형광염으로 배양하는 것은 형광성 단백질의 필요성을 우회하여 관련 유물및 한계를 피하고 우리의 프로토콜이 비트랜스펙트 세포에 적용될 수 있도록 합니다. 우대 핵 염색을 달성하기 위해, 하나는 우리가 최적화 한 조건하에서 SYBR 골드와 다른 아무것도 사용해야합니다.
그렇지 않으면, 총 세포 DNA는 얼룩질 수 있습니다. 라벨링 시술 하루 전에, 35mm 페트리 접시에 있는 매체의 2밀리리터에서 다섯 번째 HeLa 세포에 4 번 10배 배양합니다. 다음 아침, 페놀 레드 프리 배양 배지 의 1 밀리리터와 적절한 2X 라벨링 용액의 1 밀리리터를 추가하기 전에 PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척합니다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 후, 각 35mm 페트리 접시에서 슈퍼티티가 함유된 염료를 조심스럽게 흡인시키고 PBS 2밀리리터로 세포를 씻어내세요. 그런 다음 신선한 페놀 적색 세포 배양 배지로 세포를 공급하고 살아있는 이미징까지 빛으로부터 보호되는 세포 배양 인큐베이터로 배양을 반환한다. 라이브 세포 이미징의 경우, 이미징 세션 1시간 전, 스테이지 탑 인큐베이터를 초해상도 구조조명 현미경 단계에 배치하고 온도를 섭씨 37도로 설정하고 이산화탄소 농도는 레이저를 포함한 현미경의 모든 구성 요소에 5%로 설정하고 고배율, 고숫자 조리개 침전을 선택하여 미세한 분해능을 권장하는 미세한 구조로 제조하였다.
레이저가 워밍업되면 35mm 페트리 접시를 현미경 단계에 설치하고 안구를 사용하여 접시 바닥에 부착된 세포와 관심 있는 영역을 찾습니다. 초해상도 구조화 조명 현미경 이미지를 획득하려면 백 엔드 하이 엔드 전자곱 커플링 장치 카메라를 사용하십시오. 이미지 수집 소프트웨어에서 카메라에 권장되는 대로 높은 전자 곱을 곱한 게인을 설정합니다.
핵 추적을 위한 타임랩스 시리즈를 획득하기 전에, 미토콘드리아 염색을 위한 한 채널에서 동일한 시야의 2색 초해상도 구조화 조명 현미경 이미지를 획득하고 SYBR 골드에 대한 또 다른 것을 획득한다. 미토콘드리아 이미지 컬러 채널을 사용 하 여 미토콘드리아 얼룩에 대 한 적절 한 여기 및 방출에 설정 하 고 SYBR 금 염료에 대 한 적절 한 여기 및 뱅 패스 방출 필터를 설정 합니다. 두 채널 모두에서 가능한 가장 낮은 레이저 전원을 설정합니다.
현미경이 순차적으로만 채널을 획득하는 경우 미토콘드리아 얼룩 검출을 위해 채널을 끕니다. 소프트웨어의 Z 스택 상자를 선택 해제하여 Z 스택 인수를 해제하여 단일 초점 평면의 인수를 설정하고 가능한 카메라 노출 시간을 가장 짧게 설정합니다. 그리드의 3회전을 설정하고 여러 레이저 전력 값과 여러 노출 시간에 표지된 셀의 2차원 이미지를 획득하여 카메라 노출 시간에 레이저 전력을 최적화합니다.
미토콘드리아의 밝은 반점이 있는 구조화 조명 현미경 이미지를 거의 또는 전혀 아티팩트없이 산출하고 최적화된 설정을 사용하여 타임랩스 시리즈의 획득을 시작하는 레이저 출력 및 카메라 노출 시간을 선택합니다. 시간 경과 이미지의 분석을 위해 변환된 구조화 조명 현미경 이미지와 스팟 추적 모듈이 있는 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 열고 새로운 스팟을 클릭하여 스팟 생성 마법사를 시작합니다. 만들기 탭에서 시간이 지남에 따라 트랙 스팟을 클릭하고 마법사의 두 번째 단계로 진행합니다.
추정 된 x-y 직경을 0.1 ~ 0.15 마이크로미터로 설정합니다. 배경 빼기를 클릭하고 마법사의 세 번째 단계로 진행합니다. 히스토그램내의 수직선을 드래그하여 대부분의 뉴클레오티드가 검출될 때까지 품질 필터의 임계값을 조정하여 각 프레임 내에서 검출되지 않는 유물의 반점으로 검출된다.
마법사의 네 번째 및 다섯 번째 단계로 이동하여 자동 회귀 모션 알고리즘을 선택합니다. 최대 거리를 0.5 마이크로미터로 설정하고 최대 간격 크기를 0으로 설정합니다. 미세 조정된 매개 변수를 통해 소프트웨어가 모든 반점을 감지하고 트랙을 올바르게 빌드할 수 있게 되면 화살표 를 클릭하여 트랙 생성을 확인하고 통계 아이콘을 클릭하여 트랙 통계를 추출합니다.
그런 다음 필요한 통계 매개 변수를 선택하고 저장 As를 클릭하여 값을 정량화 및 시각화를 위해 점 CSV 파일로 내보냅니다. SYBR 금 또는 PicoGreen의 고농도로 라벨링하면 핵이 풍부하게 염색되고 세포질 내에서 얼룩지게 됩니다. 낮은 농도에서, 희미한 SYBR 금 신호는 세포질 내에서 관찰되는 밝은 반점의 패턴에서 핵 내에 나타납니다.
낮은 농도에서 PicoGreen 라벨은 주로 핵 염색을 산출합니다. 먼 붉은 미토콘드리아 염료에서 SYBR 금의 낮은 농도와 동시에 염색하면 거의 모든 SYBR 금 얼룩이 미토콘드리아 내에서 발생하며 고농도로 라벨을 부착하면 핵과 세포질이 유의하게 염색되는 결과를 낳는다. 시간 경과 이미징은 45 분 후에 핵염 염색이 포화에 가깝다는 것을 밝힙니다.
고정은 핵에 염료의 약간의 재분배를 일으키는 원인이 되고, 고정된 세포의 투과화는 미토콘드리아의 점선 염색 패턴을 제거하고 핵 염색을 향상시킵니다. SYBR 금이 고정 및 투과화 후 세포에 첨가되면 염료가 세포질과 핵을 균일하게 분산시켜 염색 특이성을 상실하게 됩니다. 슈퍼 분해능 구조화 조명 현미경에 의한 살아있는 세포 3D 화상 진찰은 미토콘드리아 내의 밝은 반점으로 미토콘드리아 핵로이드를 드러낸다.
회절 한계를 초과하는 해상도에서 핵의 위치를 추적하는 것은 대부분의 핵이 미토콘드리아 네트워크에 국한된 짧은 거리 무작위 운동을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 샘플의 고정과 호환되지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 그러나, 우리의 프로토콜은 분자와 세포기관의 형태학, 역학 및 활동의 연구를 위한 살아있는 세포 화상 진찰 기지를 둔 분석의 넓은 범위와 호환되어야 합니다.
우리의 연구는 세포 기지를 둔 기술에 대한 비 유기 염료를 리타게팅의 장점을 보여줍니다. 그것은 세포 연구에서 그들의 응용 프로그램에 대 한 다른 형광 염료의 탐구영감을 수 있습니다.
