Name: high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
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plusTipTracker MT 분석 소프트웨어 개발을위한 멘토링과이 연구에 사용 된 형광의 cDNA 구조의 대부분을 제공하는 토론, 미셸 베어드와 마이크 데이비슨 박사 클레어 M. 워터맨, 그리고 캐서린 애플게이트와 Gaudenz Danuser 특별 감사. 이 작품에서 KAM에 부여에 의해 부분적으로 지원되었다 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI)와 국립 보건원 (NIH). (부여 : 4K22HL113069).

The authors declare that they have no competing financial interests.

형태학 및 마이그레이션 실험에서 HUVECs를 사용. HUVEC를 내 EB3 표지 MT 성장 역학 라이브 세포 이미징 그들이 다음 ECM 시그널링 큐에 할당 될 수있는 MT 성장 HUVEC 형태의 변화를 측정하고 평가하기 위하여 적절하고 재생 가능한 세포 배양 조건을 필요로한다. HUVECs를 세포 모양과 운동성을 연구를위한 훌륭한 모델을 나타냅니다. 그들은 모두 가용 물리적 신호 큐에 응답하여 극적인 모폴로지를 나타내는, 형광 표지 된 cDNA를 가진 형질 감염에 매우 의무이며, 그들은 적절한 세포 배양 조건 65-70를 제공 할 때 혈관 튜브로 자신을 구성 할 수있는 능력을 유지한다. HUVEC를 예로서 일차 세포 배양은 세포가 건강 보장하기 위해 그들이 실험 동안 정상적으로 동작 할 것으로 취급에주의 세포 통로 번호 모니터링을 필요로한다. 예를 들어,시 cytoskele 조사 실험을 실시HUVEC를 전형적으로 다섯 통로 열두 주위 불균일 모폴로지를 표시하기 시작 톤 및 / 또는 세포 형태가 된 HUVEC는 열째 세포 배양 통로 이후 실험에 사용되어서는 안된다. 세포 밀도는 HUVEC의 건강과 확산의 중요한 레귤레이터이다. HUVEC 분기 조사 (상기 프로토콜을 10.1-10.4 참조) 세포 그들의 ECM과 상호 작용하는 물리적 공간을 제공하는 분 지형 돌출부를 확장하기 위해 상대적으로 낮은 밀도 세포 배양 물을 사용한다. 대조적으로, 상처 가장자리 이전 연구에서 HUVEC를 전에 상처에 단층 배양이다 (프로토콜 10.5-10.8 참조). 예컨대, 상처 가장자리 HUVEC를 비교적 비 - 분지 형태를 표시하는 바와 같이, 모서리 돌기 선도 연장, 그들은 상처에 마이그레이션 그들의 바로 이웃 세포 - 세포 상호 작용을 나타낸다. 주의 사항 및 생활 된 HUVEC에서 추적 MT 역학의 장점. 디스크 현미경을 회전하기에 좋은 방법입니다높은 시간 해상도와 공 초점 이미지 선명도를 필요로 실험 가설을 테스트합니다. 적절한 카메라와 레이저 모듈과,이 현미경의 접근 방식은 낮은 방출 형광에 민감하고 형광 현미경의 다른 유형에 비해 감소 광표백에 도움이 될 수 있습니다. 다른 다양한 종류의 세포에서 EB3 라벨링 방식을 사용하여 MT 성장 역학의 광범위한 측정을 생성하기 위해 필요로 중요한 것은이 방법은 또한 높은 시간 - 해상도 이미징 중등도 적합하다. 라벨의 EB3 방법론 MT 플러스 단부 성장 동안 형광 표지 이동 단말의 다른 방법에 비해 뚜렷한 장점을 보유하고, 또한 고유의 단점이있다. 예를 들어, 적극적으로 분해, 이동 단말의 인구 안정된 비 동적 이동 단말 (71 내지 74)의 인구 모두 포함하는 임의의 주어진 시간에 성장되지 않는 MT 어레이의 비율이 존재한다. EB3는 이동 단말이 두 집단 라벨 않을 것와따라서 이러한 두 집단의 기여는 실험 데이터의 분석에 포함되지 않는다. 전체 MT 배열을 평가하기위한 대체 방법은 형광 표지 된 이동 단말의 모든 인구로 통합하고, 성장 감소의 식별을 가능하게 튜 불린, 그리고 안정된 이동 단말의 표현에 초점을 맞추고있다. 그러나, 전체 MT 어레이 라벨링 미세 소관 조직 센터 (MTOC)으로 상기 셀의 중심에 인접 근처 MT 어레이의 비교적 높은 밀도의 세포 근처 아닌 MT 단부의 이미지 분석을 수행하는 단점이 만들어 주변 75-77. 살아있는 세포에 형광 튜 불린 형광 EB3와 이동 단말의 2 색 공동 라벨을 사용하여 실험 튜 불린 표지 이동 단말의 대부분은 또한 EB3 표지 (78)를 것을, 질적으로, 밝혀졌다. 또한, 형광 튜 불린으로 표시 이동 단말의 자동 추적하는 효율적인 방법이 없었다. 이 데이터의 폐기물 수집을 의미한다기 형광 튜 불린을 발현하는 세포에 MT 역학의 측정​​은 오류가 발생하기 쉬운하고 지루한 과정을 개별 이동 단말의 손 추적을 필요로한다. 그 결과, 표지 EB3 이동 단말의 자동 계산 분석이 다수의 세포 유형에 걸쳐 실험 체제 35,79 다양한 내에 MT 역학 실험에 적용 할 수있는 MT 동성을 측정하기위한 바람직한 방법이되었다. HUVEC 형태학 및 마이그레이션에 MT 성장 역학을 연결. 세포 골격 연구자의 관점에서 볼 때, plusTipTracker 자동 추적 분석 한 매우 유용한 적응 측정하고 MT 성장 역학 모두 전체 셀과 지역 변화를 평가하는 기능입니다. 셀 편광되기위한 요구 사항은 방향 세포 이동을위한 필수적인 전제 조건이다. 같은 편광 신호 단서는 긴 방향 세포 이동 30,31,51,54,56,80,81 주요 운전 인자로 알려져있다으로 </&gt; SUP. 예를 들면, VEGF 수용성 시그널링 분자가 내피 세포 유형 2,82-87에서 VEGF 큐 향해 액틴 중합 및 MT의 성장을 유도한다. 또한, (예를 들어, 규격 및 차원의 mechanosensing 용) ECM 물리적 상호 작용에 대한 응답으로, HUVEC를 로컬 맵 지형 돌기 신장 내의 MT 성장을 촉진하도록 조절함으로써 MT 역학을 조절하고,이 방향의 HUVEC 이동을 안내하는 역할 큐 5,31,88. 따라서, 세포 외 신호에 응답 큐 편광 골격 역학 국부 변화의 평가 실험의 필요성을 강조한다. 합니다 (EB3 방식을 사용) MT 성장 역학 HUVEC 세포 이동의 동시 실시간 세포 이미징은 이동 단말이 초의 타임 스케일에 성장하기 때문에 세포 형태 및 방향 이동의 변화는 시간의 시간 스케일로 발생하지만, 수행하기가 매우 어렵다. 그러나 두 프로세스가 긴밀하게 LINKE 있습니다디. 또, 제 2 시간 스케일상의 형광 표지 EB3 연속 신속한 촬영은 EB3 신호의 photobleaching에 리드. EB3 (1-2 분 취득 시리즈) 30 분마다 성공적이었다 짧은 촬상 시리즈를 수행하여이 문제를 해결하려고하지만 EB3 최적 발현했다 EC를 소수로 달성 될 수 있고, 그 악영향이 표시되지 않았다 반복 레이저 조명 (5)에 효과. MT 성장 역학 세포 형태 및 이동의 변화에 기여하는 방법의 해석을 가능하게하는 다른 방법은이자 (ROI) 도구 (35) (프로토콜 6.6 참조)의 plusTipTracker 지역이다. 전체 셀 MT 성장 세분화 MT 성장 트랙 후 추출하여 분석 할 수있는 사용자 정의 된 영역으로 할 트랙이 방법은 허용한다. 예를 들어, 셀 &#39;비 분지 &quot;대 영역&quot;분지 &quot;의 비교는 이동 단말의 더 성장할 것으로 밝혀졌다낮은 더욱 지속적으로 지형 영역 내의 비 분지 셀 주변부 5 비교. 편광 상처 가장자리 된 HUVEC에서 리딩 에지​​와 트레일 링 에지 MT 성장 역학의 비교는 MCAK 유도 MT 분해가 트레일 링 에지를 최첨단 내에서 구체적으로 금지되지 않지만 것으로 나타났습니다. 선도 RAC1 및 / 또는 MCAK의 인산화 돌연변이 표현 된 HUVEC의 가장자리 MT 성장 역학 후행 지역의 평가는 더 오로라-A 키나아제의 RAC1 유도 활성화는 특히 로컬 HUVEC의 편광 방향 이동을 구동하기 위해 최첨단 내에서 MCAK 활동을 억제하는 것으로 나타났다 31. 따라서, MT 성장 역학과 지형 돌출부 및 / 또는 상처 가장자리 된 HUVEC의 최첨단에서 MT 성장 역학의 지역 평가의 자동화 된 추적의 조합은 우리가 HUVEC 형태 및 마이그레이션에 MT 성장 역학을 연결 할 수있다. 기술 된 프로토콜이다 고안d를 HUVEC 문화와 실험 조사를 위해 일반적으로 간단하고 매우 반복적 인 방법을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜 세부 여러 차례의 실험 방법을 수행하거나 오류 문제에 대한 기회를 제공하는 복잡하고 시간 소모적이다. 이 프로토콜을 통해 잠재적 인 문제를 해결하기 위해 시도하는 동안, 여기에 많이 사용하거나 다른 방법 프로토콜 내에서 노트로 약칭이다 잠재적 인 문제의 추가, 자세한 문제 해결을 제공한다. 폴리 아크릴 아미드 기판에 코팅 된 커버 (프로토콜 2.2), 커버 글라스를 활성화 유리에 폴리 아크릴 아미드 결합, 폴리 아크릴 아미드를 활성화 한 다음 폴리 아크릴 아미드에 ECM 커플 링의 복잡한 특성상 발생하는 일반적인 문제 관련. 하나 특히 어려운 잠재적으로 문제가있는 단계는 폴리 -A의 노출 다음 피브로넥틴 / 폴리 아크릴 아미드 겔에 HUVECs를 배양한다2 mM의 설포 SANPAH에 crylamide 코팅 된 커버 (위의 단계 2.2.2.6). 이는 이러한 기판상의 HUVEC를 배양의 성공에 중요 술포을-SANPAH 완전히 ECM 공액 다음 실험 시스템에서 제거 될 수있다. 이것은, DDH 2 O로 세척하고 밤새 진탕에 DDH 2 O의 커버 슬립을 배양하여 수행 할 수 있습니다. 폴리 아크릴 아미드의 ECM들에 배양 된 세포가 생존하지 않으면 생존이 예상 증가 및 피브로넥틴 (단계 2.2.2.9)에 접합 한 후 술포 SANPAH의 세척을 반복보다 작은 경우 잠재적으로이 문제를 완화하기 위해, 또는 추천합니다. 프로토콜 3 (커버 슬립에 대한 cDNA를 형질 감염 및 HUVEC 배양)에 관련된 전기 천공 절차의 성공에 큰 영향은 세포의 트립신 동안 모두 HUVEC를 취급이 체결 다음 플라스틱 플라스크에서 제거하는 것입니다 일렉트로 (위, 3.3-3.4 단계). 걱정하는 것이 중요합니다트립신에, 플라스크 (일반적으로 1-2 분)의 표면에 &quot;올림&quot;로 세포에 필요한 시간을 초과하지 않는 상태에서 완전히 HUVEC를 모니터링. 트립신 과도한 시간은 세포가 피브로넥틴 - 코팅 된 커버 (34 단계)로 도금 한 후, 기판에 부착하지 않을 때까지 통상적으로 실현되지 않은 HUVEC의 사망의 주요 원인이다. 일렉트로 버퍼에 긴 시간이 정지 할 때와 유사한 중요한 것은, HUVECs를 (대부분의 일차 전지 유형) 잘 지내지 않는다. 더 큰 규모의 실험을하는 동안, 사용자는 전기를 필요로 5 개 이상의 조건​​을 가지고 예를 들어, 하나-A-시 개별 튜브 펠렛 세포 (형질 전환 당 1 개의 튜브)를 유지하고, 이들을 혼합하는 것이 좋다 , 전기 이전에 즉시 전기 버퍼입니다. 이 방법은 전기 버퍼 최대화 HUVEC 생존의 배양 시간을 최소화한다. 또한, 전체 문화 미디어에서 즉시 구조는 CR이다itical 다음 전기. 일분 이상의 다음과 같은 전기의 구조 지연이 완료 HUVEC 죽음 근처에서 발생할 수 있으므로 피해야한다. 관련된 세포 이동 분석 (프로토콜 9), 매우 높은 밀도에서 HUVEC를 배양하는 기술은 피브로넥틴 피복 된 커버 슬립의 건조를 요구 (프로토콜 3에 기재되어 있음) 기존 HUVEC 세포 배양 방법의 (단계 9.2에 기재되어 있음) 임계 변형에 따라 커버 슬립은 매우 작은 면적으로 HUVEC 배양을 가능하게하기 위해서이다. 커버 슬립이 완전히 건조되지 않았거나 피브로넥틴 커버 슬립의 사전 코팅 (단계 2.1 또는 2.2) 경우 비효율적 인 경우 종종, 커버 슬립 상에 배치되고 상기 미디어 - 함유 세포가 그 표면 장력을 잃고로 확장된다 하여 커버 슬립에서 세포의 밀도를 감소 커버 슬립 가장자리. 이 잠재적 인 문제를 해결하는 한 가지 방법은 커버 슬립에서 다음 미디어를 대기음하는 것입니다5 ~ 10 분 동안 바이오 안전성 캐비닛의 뒷면에 (여전히 35mm 접시에) 커버 슬립을 배치합니다. 이러한 조정은 접시 건조 돕기 위해 캐비​​넷 내의 공기 흐름을 허용하도록 도울 수있다. 눈에 보이는 액체가 공기 건조 후 커버 슬립에 남아있는 경우, 액체 관광 명소를 대기음 다시 바이오 안전성 캐비닛에 5-10 추가 분 동안 공기 건조를 할 수 있습니다. 완전히 이러한 잠재적 문제점을 방지 할 수있는 방법이 없다는 것을 유의하는 것이 중요하지만,이 프로토콜의 반복 실시에 문제가 덜 않는다. 또한 세포 이동 분석 (또는 일반적으로 어떤 분석)에 대한 커버 슬립을 준비 할 때, 추가 된 커버를 준비하고 여분의 HUVECs를 준비 - 투 - 갈 길을 따라 문제가있는 경우에 가지고있는 문제 해결 권장합니다. 염두에두고 이러한 문제 해결 고려, 논의 된 프로토콜과 미래 세포 생물학 연구에 그 의미의 유용성을 강조하는 것도 중요합니다. polyacr에 적용아미드 접근 방식은 광범위하고, (전술) 세포 ECM 참여의 2 차원 연구뿐만 아니라 입체 조사 (5)뿐만 아니라이 포함되어 있습니다. 이 응용 프로그램은 HUVECs를 생리적 환경에서 세포의 모양과 이동을 조절하는 방법에 대한 우리의 이해를 증가시키는 중요하며, 연구자들에게 세포 골격 변화를 조정하는 방법을 형태 학적 변화에 대한 기본적인 이해를 제공해야합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 MT 성장 동역학 측정에 집중하고 있지만, 프로토콜의 대부분은 세포 - ECM 상호 작용의 다른 측정 가능한 현미경으로 임의의 개수의 양상을 측정하도록 구성되어야 할 수있다. MT 역학에 대해, 제시된 프로토콜을 사용하여 조사 할 수있다 적어도 14 키네신 89 가족, HUVEC 극성 감독 마이그레이션에 기여의 잠재적 인 역할 각, 모든의를 포함하여, 다수의 MAP에가 있습니다. 미래 연구해야LSO 병에 걸린 상태 대 정상에서 세포 ECM 참여 대상으로 될 수있다. 여기서 제시 HUVEC 프로토콜 정상적인 혈관 항상성 과정 연구에 적용 할뿐만 아니라, 몇 가지 이름, 심장 질환, 망막 병증, 종양 성장 및 전이를 포함하여 질환 상태에있다. 내피 세포의 혈관 신생 혈관이 높은 공간 및 시간 해상도로 모니터링 할 수 있도록 세포 ECM 참여 연구에 수 현미경 연구와 의무 준수의 눈에 띄게 투명 ECM들과 폴리 아크릴 아미드 기판을 접합. 실험 방법의 이러한 종류의 이미 중요한 내피 세포의 모양, 극성, 이전의 차이 및 이들 프로세스 5,31,90을 조절 단백질의 효과를 나타 내기 위해 시작했다. 미래의 노력은 ECM 준수 및 차원의 mechanosensing의 조합이 대상과 세포 골격 역학을 조절하는 로컬 제어 단백질 역할을 할 수있다 방법을 식별하는 것을 목표로한다.

혈관 신생은 편광 방향 특이 마이그레이션 및 혈액 공급을 필요로 조직에 새로운 혈관을 형성하는 내피 세포되는 EC () 촉진 세포 외 신호 단서에 의해 트리거됩니다. 혈관 생성을 유도하는 것으로 생각 요인은 세포 외 기질 (ECM)로부터의 신호이다. 물리적 단서에 대한 응답으로되는 EC는 혈관 네트워크 1, 2의 형성 방향 이동을 안내하는 방향 특이성과 새로운 지점을 확장합니다. EC의 형태와 분기의 아키텍처는 공작 - 마이 오신 수축력 (3)의 규정을 조정하는 방식으로 미세 소관 (MT) 세포 골격의 현지화 규정에 의해 정의된다. 형성하기 위해 EC 분기 위해서는, 마이 오신-II는 로컬 현지화 막 돌기 (4)의 결과로 하향 조절해야합니다. 동시에 셀 내의 동일한 위치에, MT 성장 역학 분기 엘론 홍보 느리고 지속적인 MT 성장 결과 수정 될gation과 안정성 오. 이 조정 골격 규제되는 EC는 방향 마이그레이션을 용이하게하기 위해 자신의 형태를 극화 할 수 있습니다. 편광 세포 형태의 개발은 편광 MT 어셈블리 (6)가 필요합니다. 상피 세포 마이그레이션에서, 이동 단말은 셀 7-9의 최첨단 천천히 그리고 지속적으로 특히 성장; 신경 세포에있는 동안, 축삭 또는 수상 돌기의 시작과 신장은 이동 단말뿐만 아니라 존재해야하지만 그들은 동적으로 조립 및 분해 10 ~ 15의 과정을 겪고있다. 이와 같이, MT 성장 역학 국부 제어는 셀의 구조를 결정하고, EC를 ECM들이 탐색으로 세포 형태의 신속한 개장을 허용한다. MT 성장 동역학 분자 모터 단백질 및 비 모터 단백질 패밀리에 의해 조절되고, 미세 소관 연관 단백질 또는 미세 소관 상호 작용 단백질 (이하, REFE 지칭) MAP에로 rred. 지도는 로컬 일반적으로 세포 ECM 인터페이스 (16, 17)에서 시작 폭포 신호를 활성화 또는 비활성화 할 수 있습니다. 이동 단말에 결합 및 MT 조립 및 분해의 반응 속도를 변경하여 일단 활성,지도 기능; 따라서 로컬 셀 모양과 극성 18-20을 촉진하기 위해 MT 역학을 조절하는 기능. 유사 분열 센트로 관련 키네신 (MCAK)는 MT 끝나고 커플 MT 분해 21-23로 ATP 가수 분해에 결합하는 키네신-13 가족 MAP입니다. MCAK의 기능적 역할이 방추사 24-28 내의 중요한뿐만 아니라 계면 29,30 동안 알려져있다. 계면되는 EC 내에서 MCAK 매개 MT의 분해는 상처 가장자리하는 RAC1 작은는 GTPase의 유도 활성화를 응답 MCAK 지역화 오로라-A에 의한 인산화에 의해 조절된다. 이 신호 전달 캐스케이드의 결과 르 향하여 편광 MT 성장 초래되는 EC의 선단에 MCAK의 억제이다되는 EC (31)를 마이그레이션의 후행 가장자리에 가장자리와 MCAK 유도 MT 분해를 ading. MT 성장 역학을 측정하는 전통적인 방법은 일반적으로 형광 표지 튜 불린이나, 최근에는 형광 표지 MT 최종 바인딩 단백질 1 또는 3 (각각 EB1 또는 EB3) 중 하나의 손 추적을 사용했다. 형광 튜 불린 방식은 전체 MT 어레이 라벨의 이점을 갖는다. 유사 분열 세포 유형의 대부분은 계면 8,32,33 동안 이동 단말의 방사 방향 어레이를 유지하기 때문에, 중심체 주변의 MTS는 매우 조밀하고, 그 결과, 형광 튜 불린으로 MT 성장 분해 추적 보통 주변에 한정 셀 영역. 이러한 제한으로 인해, 형광 표지 EB 단백질 (EB1 또는 EB3)의 활용 MT 역학을 측정하는 일반적인 방법이었다. 사채는 이동 단말의 증가 플러스 엔드 레이블 있기 때문에 밝은 형광 올 (1-3 μm의) 작은 표시TS, 따라서 매우 제한된 배경 형광 34-37로 MT 중합 쉽게 식별 할 마커를 제공한다. 이동 단말 어레이의 일부만 사채 라벨은 EB 접근법의 중요한 강도를 나타낸다는 사실은, 또한 하나의 중요한 한계가 강조되지만, 그 이외의 성장 이동 단말은 EB3 방식으로 분류되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 측정하고 시간이 지남에 EB3 혜성을 추적하고 하위 세포 영역 내에서 MT 성장을 시각화 할 수있는 능력은 MT 조직의 지역 평가를 필요로하는 응용 프로그램이 접근 방식에 이상적이다. 측정 MT 성장 역학에 대한 전통적인 방법의 다른 주요 한계는 매우 큰 데이터 세트 및 데이터 분석에 필요한 시간이었다. 이 제한은 높은 시간 해상도에서 EB 혜성 수백의 손 추적을위한 필요성에서 유래한다. 또한, 이들 측정은 세포의 유의 한 숫자를 이루어도 제어 experime 다양한 하에서 수행 될 필요ntal 조건. 최근, 이러한 제약은 살아있는 세포 35 시간 경과 현미경을 사용하여 구체적으로 추적 EB3 혜성에 관한 전산 분석 기법을 통해 극복하고있다. 적절하게 사용되는 경우, 이러한 계산 방법은 모두 중합 MT를 측정하는 높은 처리량 방법에 대해 제공 할뿐만 아니라 손 추적과 관련된 실수의 가능성을 제한하는 역할을한다. matlab에 기반 소프트웨어 패키지를 사용하여 MT 역학의 전산 분석, plusTipTracker는 형광 표지 EB3 혜성 5,31,35,38을 추적하여 MT 성장을 측정 할 수 있습니다. 또한, plusTipTracker 소프트웨어는 성장 MT 트랙 내에서 EB3 혜성의 실종에 따라 MT 재앙 이벤트 (일명 분해)의 계산을 가능하게하고, 관심의 사용자 정의 영역 내에서 MT 성장 역학의 서브 세포 (일명 지역) 분석이 가능 . 우리의 연구의 경우, MT 성장 역학 내에서 비​​교 하​​였다비 분지 영역 대 또는 셀 에지 후행 대 선도 내의 지형 영역. plusTipTracker 소프트웨어로부터의 데이터 출력은 각각의 셀과 하위 셀 영역에 대한 컬러 코드 트랙 오버레이를 생성하는데 사용될 수있다. 여기에서 우리는 MT 성장 역학과 형태 및 방향 이동을 분기 EC의 규정이 MT의 depolymerase의 기여를 변조에 MCAK의 역할을 조사하기 위해 사용하는 방법을 설명합니다. 우리의 접근이 용이하게 배양하고 플라스미드 cDNA를 전기 유도 일시적인 형질 감염에 매우 의무이다 차 인간 세포주, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)를 사용 하였다. 우리는 그 다음 높은 해상도를 사용, 단백질 3 (EB3)와 유사 분열 센트로 관련 키네신 (MCAK) - 특정 cDNA를 바인딩 MT 끝으로 형질 전환 된 HUVEC의 시간 경과 형광 현미경은 MT 역학에 효과가 HUVECs를 형질 평가하는 구성한다. EB3의 PlusTipTracker 기반 연산 화상 해석라벨이 지정된 MT 플러스 끝 측정하고 MT 성장 역학에 대한 실험 조작의 효과를 비교하기 위해, 시간 경과 이미지에서 MT 성장 속도와 MT 성장 수명을 측정 하였다. 이 방법론은 MT 역학의 연구 및 서브 셀룰러 지역 내에서 MT 역학의 지역화 된 규정은 EC가 분기 및 마이그레이션의 혈관 신생 과정에 기여하는 방법의 식별이 가능합니다. 이러한 기술은 형광으로 표지 생균 및 발현 될 수있는 임의의 MAP의 연구에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis solution</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethyloxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% acrylamide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;mouse IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anti&amp;ndash;rabbit IgG immunoprecipitation beads</td><td>TrueBlot Reagents; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Emission Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>RPI Products</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara cooled charge-coupled device camera</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 donkey anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 goat anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Supply &amp;amp; Growth Factors (contents shown below)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine brain extract 2.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 0.5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)&amp;nbsp; 10.0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Electronic shutter</td><td>Sutter instrument</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP goat anti-rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Immuno-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin (DM1A)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Contains the electroporation buffer</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 &amp;#181;g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti&amp;ndash;pT288&amp;ndash;Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti&amp;ndash;&amp;alpha;-tubulin</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium borohydride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk&amp;nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table>

high-resolution time-lapse imaging and automated analysis of microtubule dynamics in living human umbilical vein endothelial cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

라이브 세포 현미경 HUVEC 문화 형광 단백질을 발현 된 HUVEC의 라이브 세포 이미징 HUVEC를 정상 세포의 성장 및 유지 보수뿐만 아니라, 통상의 단백질 발현 및 기능에 적합한 환경에서 유지되는 것을 요구한다. 1 프로토콜의 개략도가 버퍼링을 제조하는데 사용 나타낸다 닫힌 시스템 살아있는 세포의 시간 경과 이미지를 수집하기위한 광학 특성을 최적화 유지합니다. 양면 테이프의 얇은 스트립은 유리 슬라이드 (도 1a) 상에 배치 된 후 배양 된 HUVECs를 함유하는 커버 슬립은 세포 슬라이드 (도 1b)에 대향되도록 상기 테이프 위에 반전된다. 이러한 방식으로, 테이프는 두 유리 표면 사이에 작은 갭을 제공하고, 세포를 적절한 세포 배양 배지에 목욕을 할 수있는 공간을 생성한다 (도 1C 위에서, 프로토콜 4 참조). 나는폐쇄 된 시스템을 구축하기 위해, (도 1d 한 혼합물 VALAP 1 : 1) 라놀린 : 파라핀 왁스 (NA)의 마지막 단계는 유리 커버 슬립은 석유 젤리를 사용하여 슬라이드 유리로 밀봉된다. 이 세포 배양 방법은 짧은 시간 시퀀스 EB3 혜성의 이미징 긴 분지 시계열 이전 실험에서 모두 사용되었다. 또한 VALAP의 왁스 형 일관성 고정하고 immunolabelling 포함한 보조 접근법 (프로토콜 8 참조)되도록 실험 촬상 끝에 유리 슬라이드 및 커버 슬립에서 쉽게 제거 할 수 있으며, 동일한 커버 슬립 세포 샘플에 대해 수행 될 수있다 즉 라이브 셀 이미징 방식을 사용하여 시각화 하였다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig1.jpg" /> 그림 1 :. 라이브 세포 현미경 이미징을위한 HUVEC 문화의 방법론 (A)는 0.65 cm × 2에 양면 테이프 2 개를 잘라.50cm 직사각형 스트립 및 상기 슬라이드의 하단을 따라 가로 슬라이드의 상부 가장자리를 따라 양면 테이프 조각, 다른 부재를 고정. 이 (D)에 기재된 바와 같이, 챔버 밀봉 용 테이프와 슬라이드 가장자리 사이의 작은 공간을 허용하는 것이 중요하다. (B) 집게 된 HUVEC를 함유하는 커버 슬립을 제거 테이프 조각 위에 커버 슬립 (아래 셀측)을 거꾸로 사용. 마이크로 피펫 (C)는, 커버 슬립하고 유리 슬라이드 사이 (25 μM HEPES가 보충 완전한 내피 기초 배지) 영상 매체의 40 μL를 추가한다. 커버 슬립 및 슬라이드 사이의 공간이 완전히 영상 매체로 가득되었는지 확인하고 거품을 피하십시오. 필요한 경우, 초과 용지를 제거하기 위해 커버 슬립의 가장자리를 따라 흡입기를 사용합니다. (D) 따뜻한 VALAP를 사용하여 (1 : 1 : 1 바셀린 : 라놀린 : 파라핀)은 커버 슬립의 가장자리 주위에 밀봉하기. 영상 미디어 누설 확인커버 슬립에 조심스럽게 주위를 밀어들. 해결하기 위해 추가 VALAP를 사용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 형광 표지 EB3의 자동화 된 추적은 전체 세포 및 지역 MT 성장 역학의 포괄적 인 분석이 가능합니다. EB3 단백질의 명확한 구별 높은 시공간 - 분해 현미경 이미지의 수집은 셀 내의 EB3 운동의 분석에 필수적이다. 형광 표지 EB3의 발현 HUVEC 세포와 형광 강도는 전형적으로 시간의 기간에 걸쳐 동일한 셀 내에서 증가하는 세포에서 광범위하게 다양하다. 따라서, 고려 MT 성장 역학 증가 EB 발현의 잠재적 인 효과를 식별하기 위해서 발현 프로파일의 변경을 모니터링하는 것이 중요하다. 이것은, 평가 계조 형광 intensit함으로써 달성된다Y 각 묘화 셀에 대한 정보, 다음 계조 발현 프로파일의 정의 된 범위를 표시하는 해당 셀에 데이터 분석을 제한. 발현 프로파일 데이터 세트의 초기 평가가 중요하며, 각 셀 plusTipTracker 소프트웨어에 의해 얻어지는 MT 성장 동역학 데이터와 비교한다. 발현 양상은 순서 계조 표현의 원하는 범위를 결정하고 잠재적 인 특이점을 식별하기 위해서는, MT 성장 속도 실험 그룹 내의 각 셀에 대해 MT 성장 수명에 대해 도시 될 수있다. HUVEC은 피브로넥틴 기판 상에 배양 그림 2 하이라이트 (위의 프로토콜 2.1 참조) 및 매플 표지 EB3의 최적 수준 근처 표현. 형광 EB3 혜성이 12 초 (도 2a)에 걸쳐 이미지의 저속 직렬로 도시되어있다. plusTipTracker 소프트웨어를 사용하여 EB3 혜성의 분석 자동화, 프레임 별 EB3 혜성의 DETE을 포함ction (녹색과 노란색 점, 그림 2B). 각 프레임 내에서 검출 혜성은 다음 EB3 트랙과 시각적 EB3 트랙 오버레이 (그림 2C-F)를 생성하기 위해, 프레임 간에서의 위치에서 자신의 변화에 의존, 연결되어 있습니다. 트랙 오버레이 컬러 코딩 및 색 차이는 사용자에 의해 입력 된 파라미터에 의해 결정될 수있다. 일반적으로, 이러한 차이는 MT의 성장 속도와 MT 성장 수명 5,31의 전체 평균을 사용하여 네 개의 그룹들로 데이터를 분할 : 느리고 단명 (적색), 느리고 장수 (황색), 빠르고 단기 (녹색) 살고, 빠르고 수명이 긴 MT 성장 (파란색도 2G). EB3 표지 MT 성장 역학의 PlusTipTracker 매개 추적도 관심 (로아)의 사용자 정의 영역 수 있습니다. PlusTipTracker하여 MT 성장 dynam의 비교를 허용하는 사용자 정의 ROI (도 2A, B 및 F) 내에서 MT 성장 트랙 데이터를 추출동일한 셀의 다른 지역에서 ICS. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig2.jpg" /> 그림 2 : EB3 혜성 탐지, 추적 및 plusTipTracker 데이터 출력 HUVEC 표현 매플의 EB3의 (A) 시간 경과 영화.. 왼쪽 패널은 셀 경계를 demarking 전체 셀보기 및 전체 셀 마스크 (흰색 선)를 보여줍니다. 빨간색 상자는 시간 경과 이미지 (오른쪽 패널)에 표시된 확대 된 영역을 나타냅니다. 오른쪽 패널은 연속 영상 프레임 (- t = 12 초 t = 0 초)에 EB3 혜성의 원시 그레이 스케일 시간 경과 이미지를 보여줍니다. (A)에 도시 된 이미지에서 EB3 혜성의 (B) plusTipTracker 검출. 왼쪽 패널은 검출 혜성 (노란색 점)의 전체 셀보기를 보여줍니다. 빨간색 상자는 시간 경과 이미지 (오른쪽 패널)에 표시된 확대 된 영역을 나타냅니다. 오른쪽 패널은 오 검출 EB3 혜성 (빨간색 화살표)를 선택하고 12 초 영상 기간 동안 5 개의 혜성을 추적. 녹색<html> 점은 이전 시간 간격에 존재하지 않는 (또는 검출되지 않았다) EB3 혜성 검출 나타낸다. (C) (A)에 도시 EB3 혜성의 61 프레임 (2 분 동영상)의 최대 강도 투사. (D) (C)에 도시 된 바와 같은 프레임 (61) (2 분 동영상)의 plusTipTracker MT 트랙 오버레이. 최대 강도 투사 (E) 줌 (C에서 빨간색 상자). 최대 강도 투사의 plusTipTracker MT 트랙 오버레이 (F) 줌 (D에 빨간색 상자). (G) 트랙 (D)에 도시 오버레이 (F)에 대한 전설 색상은 구분. 지정 느린, 빠른, 짧은 수명 또는 오래 살았다는 열 매플-EB3 표현 된 HUVEC의 그룹에서 측정 된 모든 성장 트랙에 대한 평균 값을 기반으로합니다. 쉽게 시각화, (D) 및 (F)의 트랙 오버레이 (A)에 도시 된 셀의 반전 이미지 픽셀의 강도를 사용하여 생성된다. 스케일 바는 20 μm의 =./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. HUVEC은 분기 및 마이그레이션 패턴은 ECM에서 신호 물리을 메카에 민감하다. HUVEC를 잘 특정 시그널링 큐 (들)에 대한 적절한 36,40-42 세포 반응을 지시 형태 학적 변화를 겪는 데, 그렇게함으로써 시그널링 큐의 여러 유형에 반응하는 것으로 알려져있다. HUVECs를가 피브로넥틴 코팅 된 유리 기판 (그림 3A)에 배양, 또는 뻣뻣한 2 차원 폴리 아크릴 아미드 ECM들에 (55 kPa의)는 일반적으로 몇 가지 독특한 지형 돌출부 (그림 3B)와 원형 또는 긴 형태를 표시합니다. 그러나, 배양 매우 부드러운 2 차원 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (0.7 kPa의)에, HUVECs를가 발생하는 것으로 알려져있다 높은 분지 형태 표시 아래의 준수를 유도마이 오신-II의 수축력 4,5,31 (그림 3C)의 규제. 따라서, HUVECs를은 ECM의 mechanosensing를 통해 자신의 세포 형태를 조절하고,이 MT 역학과 공작 - 마이 오신의 수축성의 지역화 변조를 통해 달성된다. HUVEC를 분지 HUVEC를 측정하기 위해, 형태 학적 특성의 다양한 표시 때문에 제 분지 돌기가 무엇인지 정의하고 지형 돌출부를 객관적으로 측정하는 방법을 정의하는 것이 중요하다. 하나의 기술은 셀 경계 또는 &quot;마스크&quot;셀 가장자리 (도 3D)을 정의하는 형광 볼륨 마커를 발현하는 세포의 화상을 사용하여 상기 셀의 가장자리를 추적 수동으로 생성하는 4 단계 접근법을 사용한다. 마스크 생성 후, 분기 기원은 지형 돌출부와 전지 본체 사이 곡률 큰 각도의 위치에 의해 정의된다. 라인은 DEMA에 그려진RK은 &quot;분기 원&quot;(보라색 각진 라인도 3E). 분기의 수가 정의 된 분기 원 (도 3f)와 분기 횟수를 카운트하는 것만으로 측정된다. 분기 길이는 말단 지점 팁 (도 3G)로 분기 원점으로부터의 거리를 측정한다. 데이터 분석에서 작은 lamellipodial 돌기의 포함을 방지하기 위해, 추가 기준은 (이하 &quot;분기 원&quot;에서) 폭보다 분기 ( &quot;분기 길이&quot;) 이상이어야 할 것을 요구하고, 가지의 길이는 5에서 적어도 10 미크론해야 31. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54265/54265fig3.jpg" /> . 그림 3 : HUVEC 분기 형태의 분석 (A - C) 된 HUVEC의 DIC 이미지 예 피브로넥틴 코팅 유리 ECM들 (A) 딱딱한 (55 kPa의) 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (B) 및 소프트에서 배양 (0.7kPa의) 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (C). 엄격한 ECM들 (A, B)에 비해 극적으로 0.7 kPa의 폴리 아크릴 아미드 ECM들 (C)에서 배양 된 HUVECs 증가된다 분지. (D). 매플-C1 cDNA를 구축 발현하는 형질 전환 된 HUVEC의 DIC 현미경 이미지 (왼쪽 이미지) (셀 볼륨 마커를 우측 이미지). (상기 멤브레인은 최대 곡률을 표시하는 위치, 즉, 자주색 라인) (E)의 곡률의 큰 각도로 배치함으로써 분기 원을 정의하는 직선과의 각도를 연결 한 다음 분기의 양쪽과 (청색 선) . (F) 확인 및 (E에 정의)은 &quot;분기 원&quot;에서&gt; 10 μm의 연장 분기 돌기을 선택. 수득 지형 돌기의 수를 카운트 &quot;분기 참조.&quot; (G)는 MO에게 &quot;분기 원&quot;의 중심으로부터의 거리를 측정얻기 위해 NIS 요소 소프트웨어의 주석과 측정 응용 프로그램에서 줄 도구를 사용하여 지점의 일 말단 지점 &quot;지점의 길이를.&quot; 스케일 바는 20 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 감지 ECM 준수뿐만 아니라, HUVECs를 또한 감지하고 스크래치 상처에 의해 유도로 인접 세포 접촉의 제거에 응답합니다. 마이그레이션 분석에서, HUVECs를이 단층에서 배양는 스크래치 상처를 실시하고 마이그레이션 특성 (위의 프로토콜 9 참조)를 측정한다. 단층을 긁어서 상처 유도 후, 상처 가장자리 HUVEC를 상처 (도 4a, t = 0 시간)로 연장 돌출 선단을 개발하여 편광. 10-12 시간의 시간 과정 동안, 편광 상처 가장자리 HUVEC를 상처 영역으로 이전하고 채우기상처 새로운 합류 단층 확립 (도 4A는, t는 시간을 11 =). HUVEC가 분기와 마찬가지로, 현재 증거는 편광 및 마이그레이션이 (가) MT의 조정을 다시 조직과 액틴 cytoskeletons 43-49에 따라 비판적으로 종속되어 있음을 시사한다. 이 아닌 상처 가장자리 된 HUVEC (31)의 후단에, 선단에 MCAK 유도 MT 분해 지역화 억제를 통해 부분적으로 달성된다. MT 역학의 감도는 상처 유발하는 오로라-A 인산화 및 최첨단 MCAK을 억제 키나제 및지도를 억제하거나 활성화 할 수있는 다른 키나제 등 다양한 다운 스트림 조절 단백질을 대상으로하는 RAC1는 GTPase에 의해 시작 편광 로컬에 MT 성장을 조절하고 18,31,36,48,50-53을 수축. 광범위한 실험 증거는 가장자리 돌기를 선행 및 후행 에지 수축의 조정이 RAC1 활성화의 사이클을 통해 적용되는 개념을 지원이에 관한 운동 9,41,51,52,54-58 운전, 트레일 링 에지에서 공작 - 마이 오신의 수축성에 최첨단의 MT 어셈블리에서 RhoA의 활성화를 촉진합니다. 지금까지, 세포 이동을 자동 추적을 수행하는 설정 방법이 없다. 이는 계산적으로 감긴 가장자리 셀 편광 및 이주로 일관 변화 셀 ECM 경계를 분석하는데 어려움의 결과이다. 다양한 소프트웨어 프로그램이 형광 표지 된 세포를 59-64 추적 할 수 있지만, 상처 가장자리 이전 실험에서 HUVEC를 표지 형광 인구 총 HUVEC 인구의 30-40 %로, 따라서 상처 가장자리 세포의 대부분은 반드시 위상 대비 또는 DIC 영상으로 시각화 될 수있다. 또한, 상처 가장자리의 이동을 측정하는 특정 식별하기 위해 동일한 상처 내에 형광 및 비 형광 세포를 평가할 때 중요표현의 효과는 실험적 연구 그룹 내에서 실험적 연구 그룹 사이에 모두 구성한다. 현재 HUVEC 이동을 측정하는 가장 좋은 방법은 상처 가장자리 셀 먼저 식별하고 핵과 핵소체는 (도 4b)에 의해 식별 된 손 추적 방법을 사용하는 것이다. 핵소체 인해 높은 광산란 밀도가 상대적으로 작은 크기로 휴대 추적, 위치 결정 요소로서 사용된다. 핵소체의 이러한 두 특징은 쉽게 식별하고, 사용자가 각각의 트랙 위치에 배치 할 수있는 영역을 제한함으로써 측정 오차를 줄일 수 있도록. HUVEC 마이그레이션 트랙이 후 연속적인 시간 경과 이미지 프레임에서 핵소체를 클릭하여 생성됩니다. 마지막으로, 원점 이동 속도와 이동 거리 측정 및 제어 및 실험 셀 그룹 (그림 4B)에 대한 분석된다. <img alt="그림 4"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg&quot;/&gt; 그림 4 : 상처 가장자리 된 HUVEC 및 마이그레이션 추적 분석 스크래치 상처 가장자리 된 HUVEC (일명 &quot;마이그레이션 분석&quot;)의 11 시간 시간 경과 영상 시리즈의 (A) 20X 위상 콘트라스트 이미지.. 이주의 상처와 방향은 패널 t = 0 시간으로 표시됩니다. 세포 단층이 형성 될 때까지 HUVEC를 상처에 상처 가장자리 미리 교차하도록 도시되​​어있다 (이 t = 3.5 시간이 - t는 시간을 11 =). (B) 이동 분석 시간 경과 영상 분석 (A에 도시 된 바와 같이) 제 1 셀의 위치에 기초하여 추적 가능한 상처 가장자리 HUVEC의 식별 (물리적 상처의 가장자리, 즉 세포) 및 발현 프로필 (나는 전화부 필요하다. 실험이 GFP의 발현을 포함하는 경우) 녹색 상처 가장자리 셀을 선택합니다. 위상 콘트라스트 이미지를 사용하여, 핵 및 핵소체를 식별한다. 손은 An을 사용하여 연속적인 시간 경과 이미지에서 핵소체를 추적NIS 요소 소프트웨어의 표기법과 측정 응용 프로그램 원점 이동 속도와 거리를 결정합니다. 스케일 바 = 100 μm의 (A), 20 μm의 (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54265/54265fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.0K 조회수.  University of the Sciences in Philadelphia. Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed. 

비디오: High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

인간 제대 베인 내피 세포의 절연 (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

연구

생물학

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

면역학 및 감염병학

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

생체공학

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

의학

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

마이크로 혈관 구조에서 필드 와이즈 흐름의 공간 시간 분석

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

인간 1차 피부 섬유아세포를 기반으로 한 헌팅턴 병 모델의 마이크로튜블러 플러스 엔드 다이내믹스 시각화

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

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