이 프로토콜에서는 전혈에서 생존력이 높은 말초 혈액 및 단핵 세포(PBMC)를 수집하고 저장하는 방법에 대한 따라하기 쉬운 단계별 자습서를 제공하는 것을 목표로 합니다. PBMC에는 림프구, 수지상세포 및 단핵구가 포함됩니다. 벌크 PBMC는 개별 세포 유형을 분리하기 위해 처리할 수 있으며 RNA 염기서열분석 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 및 분석에 일반적으로 사용됩니다.
PBMC 외에도 EDTA 플라즈마 및 전체 버피 코트를 수집하는 방법도 시연합니다. 이 프로토콜을 시작하기 전에 표 2에 나열된 재료와 시약을 준비하십시오. 이 프로토콜은 6개의 밀도 구배 원심분리 튜브에서 PBMC를 수집하기 위해 설계되었으며, 각 튜브는 약 1,200만 개의 세포를 생성합니다.
그에 따라 크기를 조정합니다. 표준 정맥 절개술 기술을 사용하여 6개의 밀도 구배 원심분리 튜브와 1개의 EDTA 튜브에 채워질 때까지 전혈을 수집합니다. 모든 튜브를 1800g에서 실온에서 20분 동안 원심분리합니다.
필요한 경우 수집된 튜브를 최대 4시간까지 보관한 다음 동시에 처리할 수 있습니다. 원심분리기 작동 방법에 대한 데모는 추가 비디오 1을 참조하십시오. 밀도 구배 매체를 포함하는 튜브의 원심분리 후 플라즈마와 PBMC는 밀도 구배 매체 위에 있습니다.
적혈구와 과립구는 바닥에 가라앉습니다. 시각화에 대해서는 그림 1A를 참조하십시오. 원심분리 후 밀도 구배 원심분리 튜브를 조심스럽게 엽니다.
전사 피펫을 사용하여 플라즈마가 포함된 반투명 노란색 층을 제거하고 폐기합니다. 밀도 구배 매체 바로 위에 있는 흐릿한 세포 층을 방해하지 마십시오. PBMC를 버리는 것보다 과도한 혈장을 남겨두는 쪽에 잘못을 저지르십시오.
모든 튜브에 대해 반복합니다. 새로운 전사 피펫을 사용하여 각 튜브에 세포와 잔류 혈장을 포함하는 나머지 부피를 밀도 구배 매체 위로 여러 번 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다. 재현탁 후, 튜브의 재현탁 내용물을 라벨이 부착된 50mL 코니컬 튜브에 피펫팅합니다.
모든 튜브에 대해 반복합니다. 50mL 튜브를 50mL 라인까지 붓고 용액 1을 채웁니다. 50mL 튜브를 300g에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다.
섹션 2에 자세히 설명된 혈장 및 버피 수집 프로토콜은 이 기간 동안 완료될 수 있습니다. 원심분리 후 펠릿에는 PBMC가 포함되고 상층액에는 혈소판과 잔류 혈장이 포함됩니다. 가능한 한 많은 상층액을 버리십시오.
필요에 따라 탭하여 잔여 방울을 제거합니다. 용액 2의 15mL 튜브를 PBMC 펠릿이 들어있는 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다. 펠릿을 재현탁하기 위해 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.
전사 피펫을 사용하여 용액 3 15mL를 흡입합니다. 50mL 튜브에 적하에 추가합니다. 용액 3에는 실온에서 세포에 독성이 있는 DMSO가 포함되어 있습니다.
즉시 처리할 준비가 될 때까지 솔루션 3을 추가하지 마십시오. 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집어 섞습니다. 다중 분주 피펫을 사용하여 사전 라벨링되고 사전 냉각된 각 cryo 바이알에 1mL의 PBMC를 채웁니다.
다중 분주 피펫 작동 방법에 대한 시연은 보충 비디오 2를 참조하십시오. 크라이오 바이알을 미리 냉각된 냉동 용기 안에 넣습니다. 그런 다음 용기를 섭씨 80도의 냉동고로 옮깁니다.
냉동 바이알을 냉동 용기 내부에 최소 12시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 섭씨 영하 80도에서 라벨이 붙은 보관 상자로 옮깁니다. 또는 장기 보관을 위해 냉동된 cryo 바이알을 액체 질소로 옮깁니다.
원심분리 후 최상층은 혈장으로 구성되고 하단층은 적혈구가 포함되며 계면은 버피 코트가 됩니다. 시각화에 대해서는 그림 1B를 참조하십시오. 새로운 전사 피펫을 사용하여 버피 코트 층을 방해하지 않고 가능한 한 많은 플라즈마를 흡입합니다.
그런 다음 0.5mL 분취액을 사전 라벨링된 크라이오 바이알에 분주합니다. 버피 코트 층을 흡입하고 적절하게 라벨이 부착된 cryo 바이알로 옮깁니다. 일부 혈장과 적혈구는 버피 코트 컬렉션을 오염시킬 수 있습니다.
수집 후에는 극저온 바이알을 섭씨 80도의 음의 냉동고에 보관하십시오. 또는 장기 보관을 위해 액체 질소에 보관하십시오. PBMC 해동 프로토콜을 시작하기 전에 표 3에 나열된 재료와 시약을 준비하십시오.
이 프로토콜은 약 200만 개의 세포가 들어 있는 1.5mL 튜브 1개의 해동을 위해 설계되었습니다. 그에 따라 크기를 조정합니다. 세포의 절대 수는 환자와 치료 조건에 따라 크게 다를 수 있습니다.
드라이아이스를 사용하여 냉동 PBMC를 보관에서 옮기고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 약 4분 동안 해동합니다. 원하는 경우, 서면 프로토콜의 섹션 4에 자세히 설명된 대로 세포 계수 및 생존도 측정을 위해 부분 표본을 취할 수 있습니다. 해동 후 각 크라이오 바이알에 용액 4 1mL를 추가합니다.
그런 다음 해동된 모든 PBMC 튜브에 대해 10mL의 용액 4가 들어 있는 사전 라벨이 부착된 50mL 튜브에 내용물을 붓습니다. 탭하여 잔여 방울을 제거합니다. 빈 50mL 튜브에 세포 여과기를 놓고 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 붓습니다.
필요한 경우 가볍게 두드려 표면 장력을 끊습니다. 변형된 세포가 들어 있는 각 튜브를 400g에서 실온에서 7분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 DMSO가 함유된 상층액을 붓습니다.
필요에 따라 탭하여 잔여 방울을 제거합니다. 세포 배양 배지 또는 유세포 분석 항체 칵테일과 같은 다운스트림 실험 요구 사항에 적합한 원하는 매체에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 실험을 계속합니다.
PBMC 수집 및 동결 보존 후, 56개의 고유한 샘플에서 해동된 PBMCs, 단핵구 및 림프구의 생존력은 그림 2A에 표시된 제조업체의 지침에 따라 표 4에 나열된 시약을 사용하여 유세포 분석에 의해 평가되었습니다. PBMC, 단핵구 및 림프구의 평균 및 표준 편차 생존율은 각각 94 플러스 또는 마이너스 4%98 플러스 마이너스 1.1% 및 93 플러스 또는 마이너스 5.6%입니다. 도 2G와 같이 달성되었다. 트리판 블루 배제에 의한 생존도 측정은 평균 생존율이 88 플러스 마이너스 7.5%이고 세포 수가 2.3 x 10 에 6 플러스 또는 마이너스 1.9 x 10 에 6인 것으로 나타났습니다. 유세포 분석 분석은 또한 살아있는 단핵구가 전체 PBMC의 17 플러스 마이너스 5.9%를 차지하고 림프구가 53 플러스 마이너스 13%를 구성한다는 것을 보여주었습니다.
그 후, 유세포 분석을 통해 59개의 고유한 샘플에서 해동된 PBMC에서 단핵구를 분류하고 다른 곳에 설명된 대로 라이브러리 준비 및 RNA 시퀀싱을 위해 제출했습니다. 그림 3A 및 B와 같이 93 플러스 또는 마이너스 6.3% 읽기 정렬 및 49.6 플러스 또는 마이너스 1.4 GC 콘텐츠로 평균 및 표준 편차, 총 서열 수 18 플러스 또는 마이너스 1,630만, 56개의 고유한 샘플의 하위 집합으로 평균 및 표준 편차, 고유하게 매핑된 읽기 비율, 88 플러스 또는 마이너스 3.6%의 판독 비율이 발견되었습니다. 이러한 매개변수는 고품질 RNA 염기서열분석을 포함한 다운스트림 애플리케이션에 적합한 실행 가능한 PBMC가 이 프로토콜을 사용하는 모든 수준의 실험실 교육을 받은 작업자에 의해 얻을 수 있음을 보여줍니다.
이 프로토콜을 수행할 때, 특히 실온에서 세포에 독성이 있는 용액 3을 추가한 후에는 세포 사멸을 방지하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 또한 손상을 최소화하기 위해 셀을 부드럽게 다루어야 합니다. 이 프로토콜은 PBMC, EDTA 플라즈마 및 버피 코트의 분리를 위한 효율적이고 따르기 쉬운 분석법을 제공합니다.
이러한 면역 세포는 다양한 생물학적 맥락에서 면역 체계의 역할에 초점을 맞춘 광범위한 실험 및 분석에 사용할 수 있습니다.
