The syngeneic rat mesothelioma II-45 cell line was a kind gift from A/Prof. Emanuela Felley-Bosco, Zurich University.

동물과 관련된 모든 절차는 과학적인 목적을위한 동물의 관리 및 사용을위한 연습의 호주 코드의 권장 사항에 따라 수행되었다. 본 연구의 프로토콜은 로얄 노스 쇼어 병원 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 여성 피셔 344 쥐 (F344, 1백50-2백그램)가 컨즈 시설 유지하고, 표준 조건 (12 시간 빛 / 어둠 사이클과 음식과 물을 무료로 이용할 수)에서 Kolling 연구소. 참고 : 모든 실험 절차에 대한 흐름도는 그림 1에 제시되어있다. 이식 용 세포의 1. 준비 <ol><li> (또한 IL-45로 알려진; 청석면 석면 복막 도입에 의해 유래) 배양 래트 중피종 II-45 세포주에 RPMI 1640는 (RPMI) 매체 (37 °를 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충 된 표준 조건에서 성장 5 % CO 2)와 C 가습 인큐베이터. 터 유지 보수75cm 2 플라스크에 계대 두 번 하위 배양 약 1시 50분 주일로한다. </li><li> 37 ° C에서 세포 배양과 따뜻한 분취 시약을 준비합니다. 필요한 시약은 10 % FBS, 인산염 완충 식염수 (PBS)와 0.5 % 트립신 EDTA와 혈청 무료 RPMI 미디어 (SFM), RPMI을 포함한다. </li><li> 약 70-80% 합류에 주입 문화 세포. 이것은 그들이 선형 증식기에 보장한다. </li><li> 미디어를 폐기 멸균 PBS의 5 ㎖로 한 번 세척 한 후 3 ㎖ 0.5 %의 트립신 EDTA를 추가하여 수확 세포. </li><li> 모든 세포는 비 부착 될 때까지 약 5 분 동안 인큐베이터에 플라스크를 돌려줍니다. </li><li> 세포를 비 - 부착되면, 트립신을 불 활성화하고, 10 % FBS RPMI에 3 ㎖를 추가한다. 수집하고 원심 분리기 세포 3 분 300 XG에. </li><li> 3 분 동안 300 XG에 다시 SFM 원심 분리기 10ml에 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 10 SFM ㎖의 원심 분리기 위와 같이 다시 세척 세포 펠렛. </li><li> SFM 10ml에 세포를 재현 탁 및 혈구 또는 유사한 장비를 이용하여 세포 수를 수행한다. </li><li> 100 μL를 주입 할 수있는 세포의 양을 함유하도록 세포를 희석. 주 : 종양 성장 100 100 μL 셀이지만 표준 투여 량은 100 μL 500,000 세포만큼 낮은 용량으로 입증되었다. </li><li> 쥐의 수 (즉, 100 μL / 쥐)를 이식하는 미디어에 충분한 세포를 준비 플러스 프라이밍과 바늘의 죽은 볼륨에서 손실을 보상하기 위해 적어도 0.5 ml를 추가. </li><li> 준비 (전지 제외) 충분한 SFM은 대조군 (즉, 100 μL / 쥐)에 이식 할, 플러스 적어도 0.5 ml를 추가. 세포 및 SFM은 이제 주입 준비 :합니다. 그들은 37 O C로 유지하고 생존을 유지하기 위해 수확의 2 시간 내에 이식해야합니다. </li></ol> 세포의 2. 생체 주입<ol><li> 유도 챔버로 F344 래트 (&gt; 13 세 주) 놓고 1.4 % 이소 플루 란 흡입 (또는 설비에 사용 방법)을 사용하여 마취. 쥐 (흐르는 1.4 %의 이소 플루 란) 코 콘에 실에서 잠 움직임을 것으로 나타나면, (복부보기)을 위로 향하게 가슴의 뒷면에 배치합니다. 이 내부 장기 멀리 흉강에서 해결 할 수 있습니다. 쥐를 보장하기 위해 기관 프로토콜에 따라 반사 신경을 확인하는 것은 완전히 마취됩니다. </li><li> 모피를 제거 할 권리 레지오의 costalis (가슴) 영역을 면도. </li><li> 80 % v / V를 에탄올로 면도 영역을 청소합니다. </li><li> 주사 부위를 확인 : 오른쪽에, 2 선이 두개 시작 찾을 수 있습니다. 주사 부위는 흉곽의 꼬리 끝에서 3 번째와 4 번째 늑골 사이에있는이 0.5 cm 근위입니다. (도 2A). </li><li> 부드럽게 재현 탁하는 II-45 세포를 섞는다. 천천히 1 ml의에 세포 현탁액 (또는 대조군에 대한 SFM)을 그릴 &amp;# 160; 부착 된 바늘없는 주사기. 바늘 세포의 드로잉 처리를 위해 연결되어 있다면, 세포가 바늘 주입 라인을 따라 증가 할 가능성이있다. 23G X 1¼ 바늘을 연결합니다. 프라임 바늘과 모든 공기 방울을 제거한다. </li><li> 주사기 및 바늘 프라이밍되면, 바늘 축 위에 20mm 길고 직경 5mm 스페이서 배치. 이것은 주입하는 동안 흉강으로 너무 깊게 침투하는 바늘을 방지하기 위해 사용된다. 노출 바늘 약 5mm-12mm 어떤 장기를 손상시키지 않고 리브를 통해 관통하기에 충분하다. </li><li> 천천히, 갈비뼈 사이에 바늘을 삽입 혈관 (더 혈액이 주사기에 표시되지 않아야합니다)을 100 ㎕의 세포 또는 SFM을 주입 구멍되지 않은 보장하기 위해 주사기에 다시 그립니다. (그림 2B). </li><li> 바늘을 제거하고 부드럽게 흉강에서 셀을 확산 좌우로 쥐를 굴립니다. </li><li> 케이지에 쥐를 넣고 복구를 확인합니다. 목전자의 쥐가 1 분 이내에 깨어 주위를 이동하기 시작해야한다. </li><li> 새 바늘을 사용하여 각 쥐에 대해 반복합니다. 동일한 바늘을 재사용 바늘의 주사 라인을 따라 세포 성장을 초래할 것이다. </li><li> 매일 동물의 복지를 모니터링합니다. </li><li> 기관 동물 윤리위원회에 의해 지배으로 윤리적으로 정의 된 엔드 포인트에서 동물을 안락사. 이 실험에서 쥐에 대한 윤리적 끝점은 ​​10 % 이상 또는 호흡 곤란의 체중 감소 하였다. </li></ol> 3. 꼬리 정맥 혈액 채취 <ol><li> 혈액을 사후 즉시 세포 주입 수집 할 경우, 마취 랫트를 유지한다. 또 다른 시점에서 혈액을 채취하는 경우, 1.4 %의 이소 플루 란을 흡입하여 쥐를 마취. 쥐를 보장하기 위해 기관 프로토콜에 따라 반사 신경을 확인하는 것은 완전히 마취됩니다. </li><li> 옆에 쥐를 놓고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. </li><li> 80 % 에탄올로 소독하고 꼬리를 0.5 ml의 EDTA의 C 레이블ollection 관. </li><li> 혈액을 수집하려면, 항상 (따라 방법의 약 삼분의) 꼬리의 꼬리 끝에서 시작합니다. 이는 첫 번째 시도가 실패한 경우의 꼬리 끝 뇌 더 가깝게 시도 허용한다. 이 혈전을 일으킬 수있는 꼬리 쪽 재 샘플링하지 마십시오. </li><li> 측면 정맥에 23G X 1 ¼ 바늘 평행하게 배치하고 약 10mm (그림 3A)을 관통하도록 얕은 각도로 정맥에 밀어 넣습니다. </li><li> 참고 : 정맥이 성공적으로 구멍이 된 경우 혈액이 바늘 (그림 3B)의 부착 결국 볼 수 있습니다. </li><li> 혈액의 방울은 바늘 구멍의 꼬리 부위에 형성 할 것이다. 레이블 0.5 ㎖ (이하) EDTA 수집 튜브에 피펫 및 전송을 사용하여이 피를 수집합니다. 면역 세포 분석 25 μL 충분하다. 출혈이 멈출 때까지 사이트를 천공하도록 압력 거즈를 적용합니다. </li><li> 홍보하기 위해 혈액과 EDTA를 혼합 혈액 튜브를 쓸어 넘기이벤트 응고. 혈액 수집 및 응고를 방지하기 위해 가능한 한 짧은 EDTA와 혼합 사이의 시간을 유지한다. </li><li> 분석 할 때까지 실온에서 랙에 여러 쥐 저장소 EDTA 혈액 샘플에서 혈액을 수집합니다. 컬렉션의 2 시간 내에 프로세스 혈액. </li></ol> 비드 기반 방법을 사용하여 면역 세포 프로파일 4. 샘플 준비 참고 :이 단일 플랫폼 방법은 각 샘플에 대한 구슬 알려진 번호가 상업적으로 이용 가능한 절대 계수 튜브를 사용하여 사용합니다. 이 튜브는 구슬을 해제 샘플 준비 중에 용해 동결 건조 된 펠릿을 포함하고있다. 비드 형광 표지되고 모집단 비드에 의해 게이팅 절대 카운트가 계산 될 수있다. <ol><li> EDTA 전체 혈액 샘플이 몇 분 동안 느린 회전 믹서를 배치하여 잘 혼합해야합니다. 각 샘플에 대해 하나의 절대 계수 튜브 레이블. 구슬을 포함하는 펠렛 T 아래에 표시되어야합니다상기 튜브의 하단에 그 금속 비드 홀더. </li><li> 레이블이 절대 계수 튜브에 EDTA 전체 혈액의 25 μl를 전송합니다. 비드 펠렛은 혈액의 추가에 용해됩니다. </li><li> 각각의 튜브에 방지 쥐 T / B / 자연 킬러 (NK) 세포 칵테일 20 μL, 안티 쥐 CD8a PE 10 μL, 안티 - 쥐 CD4 (도메인 1) FITC의 10 μL 및 안티 쥐의 10 μl를 추가 CD45 PE / Cy7 (그림 4A). 형광 표 1에 정의되어 있습니다. </li><li> 항체 및 세포가 튜브의 바닥에있는 관의 측면에 붙어 가지 않도록 간단히 튜브 (300 XG)를 원심 분리기. 소용돌이는 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어합니다. </li><li> 적혈구가 10 mM 트리스의 400 μl를 추가 용균하려면 0.15 M 염화 암모늄 완충액 (pH 7.5) 및 와류 믹스합니다. 샘플은 반투명과 흐린하지 (도 4B 및 C)를 나타날 때 용해가 완료됩니다. 시료가 완전히 증가로 이어질 것입니다 용균 실패개발 배경 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 때 거짓으로 수를 증가. </li></ol> 샘플 5. 유세포 처리 참고 : 흐름 cytometer 4 색에 수행합니다. <ol><li> 그림 5에 도시 된 바와 같이 획득 모드, 8 플롯와 새 템플릿에서 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 표 1 및 게이트 (R1)을 설정에게 장비 설정을 조정합니다 (FITC [FL-1] APC는 [FL-4] 대), 그림 5Ai)는 형광 구슬을 계산합니다. 다른 문이 취득 단계에서 중요하지 않지만 분석을 위해 필요합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 절대 카운팅 구슬 형광 염료를 함유하고 청색 채널에 약한 비록 모든 채널을 검출 할 수있다. </li><li> 제어 준비된 혈액 샘플, 소용돌이를 사용하고 세포 계측기에로드하고 데이터 수집 게이트들이 조절 될 수 있도록 설정 모드에 저속 (12 μL / 분)에서 실행. </li><li> 인수에 설정R1 비드 게이트 10,000 이벤트를 수집합니다. </li><li> 데이터를 기록 및 수집 메뉴에서 파일 번호와 레이블 샘플 파일을 설정하는 폴더를 설정합니다. </li><li> 샘플 사이토 상 분석 될로드 및 매체 (35 μL / 분)로 유량을 설정한다. 같은 유량으로 각 샘플을 실행합니다. 유속은 (12 μL / 분) 또는 로우 (60 μL / 분) 하이로 변화 될 필요가있을 수 있지만, 일반적으로는 적절한 매체이다. 이 속도는 각 샘플에 대한 10,000 비드 이벤트를 취득하는 데 약 90-120 초 걸립니다. </li><li> 샘플 확인 이벤트가 R1 비드 게이트에 나타나는되어 있는지 확인하기 위해 산포도를 볼로드되면. 초기 산포도에서 드리프트를 일으키는 샘플 압력 약간 불안정이있을 수있다. 이 안정 될 때까지 기다립니다. </li><li> 안정화되면, 획득을 클릭하고 샘플을 실행할 수 있습니다. 사이토는 R1 10,000 비드 이벤트를 취득 완료되면 사이토는 취득을 중지하고 모든 데이터를 저장합니다. </li><li> 샘플을 제거하고 TU 흐름 폐기수. 사이토는 이제 다음 샘플에 대한 준비가되어 있습니다. 모든 샘플을 실행 한 후 분석 모드로 진행합니다. </li></ol> 6. 면역 세포 분석 참고 : 게이팅 전략과 부울 대수는 각각의 세포 인구를 정​​의하는 데 사용됩니다. 부울 대수는 하나의 정의에서 여러 작업을 위해 할 수있는 논리 기반의 분석 방법이다. (예를 들어, BD CELLQuest) 유동 세포 계수기의 분석 소프트웨어 부울 대수의 사용을 허용한다. 방정식 구체적으로 각각의 세포 집단을 식별하는 셀을 정의하는데 도움을 위해 상당한 부정적인 반응을 적극적으로 설명하기 위해 사용된다. &#39;지역&#39;은 &#39;게이트&#39;를 정의하는 데 사용됩니다. (-, 표 2에 정의 +, *)가 게이트 대수 연산자로 연결된 다수의 영역들로 구성 될 수있는 반면, 영역은 2 차원 공간을 정의한다. <ol><li> 분석 모드로 소프트웨어를 전환합니다. 분석 템플릿에 맞게 생성되어야 <str옹&gt; 나타낸 그래프 및 게이트 그림 5. </li><li> 개별적으로 각각의 파일 (즉, 각각의 시료를) 분석 할 수 있습니다. 표 2에 정의 된 설정 게이트 R1 내지 R9로하고 (또한,도 5에 도시) 각각의 세포 유형에 대한 알고리즘을 설정. </li><li> 게이트들과 알고리즘 (표 2 및도 5)에 의해 정의 된 각각의 세포 집단을 계산하는 셀의 통계 카운터를 사용한다. 알고리즘은 셀 통계 카운터에 자동으로 세포 수를 조정합니다. </li><li> 다음 식을 사용하여 세포 서브 세트를 계산한다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53019/53019eq1.jpg" /> 주 : 카운트 셀 이벤트 수 (예를 들면, CD4 T 세포의 이벤트) 피 μL 당 세포 수를주고 상기 식을 이용하여 열거된다. 예를 그림 5에 표시됩니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 논문은 흉막 중피종의 쥐 동계 동 소성 모델과 종 채혈을 통해 질병의 진행을 모니터링하기위한 간단한 방법의 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. II-45 모델은 석면 섬유 (13)에 피셔 344 래트를 노광에 의해 개발되었다. 이 노출 중피종의 발병 기전에 대한 호스트 석면 면역 체계의 상호 작용의 진정한 역학을 나타내고 있지만, 긴 지연 시간 (생성하는 년을 복용)?...

악성 중피종 (MM)은 멤브레인 (mesothelium)로 형질 전환 된 세포에서 발생 공격적인 악성하다 라인 복강 폐, 심장 및 내부 생식 기관 및 폐 공동 또는 늑막 1,2- 가장 일반적인 차 종양은 . 석면 섬유에 노출되면 모든 MM의 80 %를 차지하고, 석면 사용에 대한 금지는 대부분의 서방 국가에서 수십 년 전에 도입 된 반면, 지역 사회에서의 광범위한 사용은 치명적인 유산을 남겼습니다. 세계 보건기구 (WHO)는 10만7천명은 전 세계적으로 계속 증가 사망률, 석면 관련 질병으로 매년 죽는 것으로 추정하고있다. 새로운 비 직업 입사 파도 대두되고이 3 피크 때, 어떤 수준에서의 작은 이해가있다. 전신 화학 요법이 유일한 실행 가능한 옵션 4 중 하나를 나타냅니다 때 MM를 가진 사람들의 대부분은 늦은 진단. 가장 effecti화학 요법과 (시스플라틴 (5)과 함께와 pemetrexed) 현재의 &#39;주의 기준&#39;을했습니다 10 년 전에 확인되었다. 이 치료의 그러나 실패는 불가피 만 12개월 2의 냉혹 한 예후 및 평균 생존 환자를 떠나 더 검증 된 제 2 라인 옵션은 존재하지 않는다. 따라서, 더 효과적인 치료법이 절실히 아직은 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 임상 시험에서 새로운 치료의 다수의 시험에도 불구하고 아무도 실제로 변화를 초래하지 않았다. 이는 임상 6-8를 설정하는, 일반적으로 이종 이식 마우스 모델에서 수행 전임상 결과 낮은 (5 %) 전입에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다. 이러한 모델은 충실히 자주 작동 면역계 9의 부재 하에서, 비 - 생리적 인 위치에서 발생하는 종양 미세 환경의 복잡한 양상 요점을 되풀이하지 않는다. 동계 동 소성 모델 C보다 훨씬 더 현실적인 종양 환경을 만들종양이 그대로 면역 시스템 10, 11과 올바른 생리 학적 위치에 발생하는 ommonly 피하 이종 이식의 모델을 사용했다. 쥐의 대형화, 특히 직렬 혈액 치료 반응 및 독성 (12)을 평가하기 위해 요구되는 무 약물 연구에서, 설치류 질병 모델로서 사용을 향상시킨다. 또한, 모델되는 질병 진행 모니터링 순환 인자에서 발견 매우 매력적이다를 사용 질병의 진행을 모니터 할 수있는 능력으로 인해 (예컨대 흉강 에서처럼) 종양의 위치가 어렵다. 면역 능력 쥐를 사용 흉막 중피종의 동계 동 소성 모델의 생성을 설명한다. 또한, 순환하는 면역 세포를 측정하여 흉막 질환 진행을 모니터링하기위한 간단하고 비교적 비 침습적 방법도 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EDTA Collection tube (0.5ml)</td>
			<td>Greiner Bio One GmbH</td>
			<td>450480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat T/B/NK Cell cocktail</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>558509</td>
			<td>anti-Rat CD3&#160; APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RAT CD8a PE&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200608</td>
			<td>(IgG1vClone G28)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>203406</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Rat CD45 PE/Cy7&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202214</td>
			<td>(IgG1 Clone OX-1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruCount&#8482; Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340334</td>
			<td>Box of 50 absolute counting tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Scientifix</td>
			<td>FBS500-S (lot# 010101-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Medicago AB</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23Gx1&#188; Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>302 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fischer 344 Rat</td>
			<td>Animal Resources Centre, Perth Australia</td>
			<td>F344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I.S.O (Isoflurane USP)</td>
			<td>Veterinary Companys Australia (VCA)&#160;</td>
			<td>B7058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II-45 Rat Mesothelioma line</td>
			<td>Zurich University</td>
			<td></td>
			<td>Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCalibur&#8482; 4 colour</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>342975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>9718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Machine (The stinger)</td>
			<td>Advanced Anaesthesia specialists</td>
			<td>#00449</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic implantation and peripheral immune cell monitoring in the ii-45 syngeneic rat mesothelioma model

백신 및 면역 검사 점 억제제, 및 치료 반응에 종양 미세 환경의 역할의 증가 이해 등의 암에 대한 면역 기반 치료에 대한 관심의 거대한 급증, 공동으로 전임상 시험에 대한 면역 능력이 동 소성 모델의 필요성을 가리 이 새로운 치료법. 이 논문은 흉막 악성 중피종의 소성을 면역 능력이 쥐 모델을 수립하는 방법을 보여줍니다. 동 소성 모델 모니터링 질병 진행은 종양의 내부 위치에 의해 혼동된다. 길이 방향으로 질병의 진행이 암의 다른 쥐 모델에서 면역 세포를 순환에 미치는 영향을 모니터링하기 위해 하나의 튜브 25 μL 전혈은 설명을 필요로 분석 유동 세포 계측법. 총 림프구, 단핵구 및 호중구뿐만 아니라, T 세포 서브 세트 CD4 및 CD8, B 세포 및 자연 살해 세포 : 이것은 정확한 일곱 면역 매개 변수의 정량화를 제공한다. 다른 서브 우퍼이러한 매개 변수는 중피종 ETS 모델에서 질병의 진행을 모니터링하기위한 큰 유틸리티를 갖는 림프구 비율 호중구와 다른 상황 및 모델에 유용하다. 또한 면역 - 기반 치료법​​에 대한 응답을 모니터링하고 치료의 성공 또는 실패로 이어지는 근본적인 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 하나의 관이 방법을 사용하여 면역 세포 수준을 순환 분석.

II-45 세포를 이용한 흉막 중피종의 소성을, 모델 생성을 위해이 문서에서 사용하는 방법은 쥐 주입법에 의한 사망하지으로, 재현성 및 빠른 시간 내에 중피종에 굴복 동물 결과. 이식 된 세포의 수의 적정 1X 10 3 세포는 완전히 침투 모델 (100 % 생착)에 필요한 최소 수 있다고 판단했다. 쥐에 이식 세포의 수는 다른 질환의 중증도에 영향을 미치는 것으로 나타나없이 질병의 시간 코스를 변경...

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Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

면역 능력이 쥐의 흉강에 II-45 악성 세포의 이식에 의한 흉막 악성 중피종의 소성을 쥐 모델의 생성이 제공됩니다. 유세포 방법도 기재되어 25 ㎕의 혈액 샘플로부터이 동물 일곱 면역 세포 서브 세트를 분석한다.

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

orthotopic-implantation-peripheral-immune-cell-monitoring-ii-45

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9.1K 조회수.  Royal North Shore Hospital, University of Sydney.  면역 능력이 쥐의 흉강에 II-45 악성 세포의 이식에 의한 흉막 악성 중피종의 소성을 쥐 모델의 생성이 제공됩니다. 유세포 방법도 기재되어 25 ㎕의 혈액 샘플로부터이 동물 일곱 면역 세포 서브 세트를 분석한다. 

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Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Orthotopic 대동맥 이식 : 만성 Vasculopathy의 개발 연구에 생쥐 모델

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

연구

의학

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에</em후보 치료 대리점> 테스트

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

폴리비닐 알코올 스폰지 모델 주입

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Intraluminal 중간 대뇌 동맥 폐색의 쥐 뇌졸중 모델에서 뇌 관류 모니터링에 최적화 된 시스템

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

&quot;환자와 같은&quot;동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation of human liver transplantation due to the absence of arterial reconnection. Described here is a modified transplantation procedure that includes the incorporation of hepatic artery (HA) reconnection, leading to a marked improvement in transplant outcomes. With a mean anhepatic time of 12 min and 14 s, HA reconnection results in improved perfusion of the transplanted liver and an increase in long-term recipient survival from 37.5% to 88.2%. This protocol includes the use of 3D-printed cuffs and holders to connect the portal vein and infrahepatic inferior vena cava. It can be implemented for studying multiple aspects of liver transplantation, from immune response and infection to technical aspects of the procedure. By incorporating a simple and practical method for arterial reconnection using a microvascular technique, this modified rat OLT protocol closely mimics aspects of human liver transplantation and will serve as a valuable and clinically relevant research model.

The goal of this study is to modify the rat orthotopic liver transplant model to better represent human liver transplantation and improve recipient survival. The presented method reestablishes hepatic arterial inflow by connecting the donor liver&#39;s common hepatic artery to the recipient liver&#39;s proper hepatic artery.

직교 간 이식의 쥐 모형에 있는 동맥 재연결 후에 감소된 합병증

The rat orthotopic liver transplantation (OLT) model is a powerful tool to study acute and chronic rejection. However, it is not a complete representation ...

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current limitations in immunosuppression and functional neuromotor recovery. Many animal models have been developed for studying unique features of VCA, but here we present a robust reproducible model of orthotopic hind limb transplant in rats designed to simultaneously investigate both aspects of current VCA limitation: immunosuppression strategies and functional neuromotor recovery. At the core of the model rests a commitment to meticulous, time-tested microsurgical techniques such as hand sewn vascular anastomoses and hand sewn neural coaptation of the femoral nerve and the sciatic nerve. This approach yields durable limb reconstructions that allow for longer lived animals capable of rehabilitation, resumption of daily activities, and functional testing. With short-term treatment of conventional immunosuppressive agents, allotransplanted animals survived up to 70 days post-transplant, and isotransplanted animals provide long lived controls beyond 200 days post-operatively. Evidence of neurologic functional recovery is present by 30 days post operatively. This model not only provides a useful platform for interrogating immunological questions unique to VCA and nerve regeneration, but also allows for in vivo testing of new therapeutic strategies specifically tailored for VCA.

This protocol presents a robust, reproducible model of vascularized composite allotransplant (VCA) geared toward simultaneous study of immunology and functional recovery. The time invested in meticulous technique in a right mid-thigh hind limb orthotopic transplant with hand sewn vascular anastomoses and neural coaptation yields the ability to study functional recovery.

다음 단계: 쥐의 기능적 회복을 극대화하기 위한 신경 응복 성 직교 힌지 이식 모델

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...

II-45 동계 쥐의 Mesothelioma 모델에서 소성을 주입 및 주변 면역 세포 모니터링

요약

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