우리는이 일 [R33 CA174616-01A1]을 자금 NIH에서 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 IMAT 프로그램을 감사합니다.

1. 대상 셀 준비 <ol><li> 37 O C에서 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 4 ㎚ L 글루타민, 500 IU / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, RPMI 1640 배지) 성장 배지에서 표적 세포 (예. 라지 림프종 세포)를 유지 5 % CO 2 인큐베이터. </li><li> 15ml의 튜브에 표적 세포 펠릿 시료를 원심 분리기. 원심 분리 시간은 다른 세포 유형에 따라 달라집니다; 라지 세포에 대한 468 XG에 3 분 동안 원심 분리. </li><li> 먼저 상층 액의 표면에 형성하는 거품을 대기음, 전체 상층 액을 제거합니다. </li><li> 튜브에 PBS의 10 ML을 추가합니다. 세포 덩어리를 분리시킨 솔루션을 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 원심 분리기 468 X g에서 3 분의 샘플. </li><li> 상등액의 표면에 형성하는 기포를 대기음, 전체 상층 액을 제거한다. </li></ol> 세포 마이크로 어레이 2. 준비 <ol><li> Obtain 세포 부착 96 웰 플레이트 키트 또는 단일 셀 어레이 8 웰 챔버 슬라이드 (재료 / 시약의 표 참조). </li><li> 키트에서 DNA 시약에 액티베이터의 1.2 μl를 적용합니다. , 유리 병 캡을 반전, 부드럽게 솔루션을 혼합 흔들어. </li><li> 이 솔루션은 실온에서 20 분 동안 반응 할 수 있습니다. </li><li> (15 ML 튜브에서) 표적 세포 펠렛에 혼합 용액을 적용합니다. </li><li> 500 nM의 최종 농도 세포질 녹색 형광 염료를 추가한다. </li><li> 오비탈 쉐이커상에서 RT에서 30 분 동안 혼합 용액 및 염료로 표적 세포를 부화. </li><li> 5 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어, 10 ml의 성장 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 각 웰 단계 2.7에서 용액 100 μl를 적용합니다. hemacytometer를 이용하여 세포 수를 계산. 확인 세포 수를 잘 당 6 ~ 10 × 10월 4일에서 1일까지 × 5 사이의 세포를 다양합니다. </li><li> 실온에서 배양 10 ~ 15 분 후, 부드럽게 200-30로 두 번 샘플을 씻어0 μL 성장 미디어는 언 바운드 세포를 제거합니다. 참고 : 약 5 ~ 10 μL 성장 미디어는 세척 후 각 웰에 남아 있습니다. </li></ol> 3. 전체 혈액 세포 독성 분석 실험 <ol><li> 물론 각각의 샘플에 인간의 전체 혈액의 180 μl를 추가합니다. </li><li> ㎖ / 5mg을에 항 CD20 항체 용액을 얻어서하도록 일련의 희석을 수행하는 50, 20, 10, 5, 2, 1, 1.5 ㎖의 튜브에 항 CD20 항체 용액 0.5 ㎍ / ml로. 각 샘플 잘 삼중를 만들기 위해 항 -CD20 항체의 농도를 각각 20 μl를 추가합니다. </li><li> 각 웰에 500nM의 최종 농도로 요오드화 프로피 듐을 추가한다. </li><li> 16 시간 동안 5 % CO 2로 37 ° C에서 얻어진 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 이미지 슬라이드 또는 8 배 배율 자동 이미징 시스템을 96 웰 플레이트에 세포. </li><li> 결과를 정량화하는 자동 촬상 시스템의 셀 카운팅 프로그램을 사용한다. 주 : 자동 촬상 시스템의 소프트웨어는 단순 제공단계별 세포 계수에 대한 작업을. 이 소프트웨어를 사용하는 프로토콜은 제공자의 웹 사이트에서 확인할 수있다. </li><li> 소프트웨어의 메인 페이지에서 [리뷰 결과]를 선택합니다. </li><li> [샘플 저​​장 한 파일]을 선택합니다. </li><li> 제 1 게이트는 FITC 강도가&gt; (50), 다음 게이트 TxRed가 강도&gt; (20)을 의미 의미한다. </li><li> [플레이트 개요]를 선택합니다. </li><li> [내보내기 테이블]을 선택합니다. 참고 :이 프로그램의 비율 세포 살해 공식은 다음과 같습니다 : % 표적 세포 살해 = (녹색과 빨간색 두 염색 된 세포의 # / 세포의 # 녹색 스테인드) * 100 % </li></ol>

<ol>
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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

WCA는 이상적으로 이러한 CDC와 ADCC 분석 9-11, 같은 및 전임상 동물 시험 전에 기존 대상 검사 한 후 사용 단일 셀 해상도 12-16,와 체외 안티 - 암 검진 도구에서 중요하다. 현재, 이러한 CDC 또는 ADCC 분석 1 차 대상 심사 분석은 모든 단순화 된 미디어 또는 버퍼 시스템에서 수행됩니다. 그러나 이러한 단순화 된 완충 시스템에서 효능을 보여 약물 후보는 항상 더 복잡한 전혈 시스템에서 효과적이지 않다. 따라서, WCA는 전통적인 타겟 상영 비싼 동물 연구 간의 격차 가양 줄이고, 따라서 동물 실험 또는 인간 임상 시험에서 예방 고장을 방지 할 수있다. WCA는 인간 전혈의 함량 약물 효능을 테스트하기 위해 전임상 연구에서 작업 연구자 유익 할 것이다. 유동 세포 계측법을 사용하여 죽은 자와 살아있는 세포를 계산하는 것은 적혈구 CE의 완전한 용해가 필요합니다순서 LLS가 표적 세포를 검출한다. 유동 세포 계측법 위에 WCA 기술의 장점은 적혈구의 용해없이 표적 세포를 식별 할 수 있다는 것이다. 그것은 완전히 혈액 샘플에서 모든 적혈구 세포를 용해하는 것은 곤란하고, 표적 세포는 또한 부분적으로 용해 과정 중에 용해된다. 스크리닝 패널 맞춤 암 치료, 주어진 종양 내 세포 이질성의 평가, 특정에 내성 세포의 식별에 방법을 포장, 개개 환자로부터 수득 라이브 일차 세포를 이용하여 생성 될 수 있다면 더욱 흥미로운 기회가 발생할 약물 치료. 인 접근법 의료 시스템 이동 &quot;예방 및 환자의 필요에 중심 맞춤, 예측은,&quot;약 (17, 18)의 미래이다. FDA, 질병 통제 센터 (CDC), NIH, 센터를 포함하여 미국 보건 복지부 내에서 많은 활동,메디 케어 및 메디 케이드 서비스 및 보건 자원 및 서비스 관리를위한 개인화 된 치료를 증진하는 조치를 지원하기 위해 존재한다. 맞춤 의학의 실현은 관련 생물학적 상태를 유지하면서 캡처 및 인간의 세포를 저장할 수있는 신뢰할 수있는 기술과 제품에 따라 달라집니다. 우리는 맞춤 의학 어플리케이션에 그 / 그녀의 자신의 혈액의 행렬에 암 환자의 종양 세포에 대한 약물을 선별 WCA를 적용 예견 할 수 있습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 셀 어레이의 제제이다. 사용자가 셀 세척 단계에서 세포를 잃지 않고 상층 액을 모두 제거해야합니다. 또한 사용자는 액체 바이알에서 볼 수없는 경우 짧은 원심 분리 할 필요가있다. DNA 시약 용액을 제조 한 후에는 30 분 내에 세포와 함께 사용되어야한다. 셀 어레이의 형성 효율은 세포 유형에 의존한다. 보다가 있었다이 프로토콜 테스트 셀 (100) 유형; 그러나, 일부 특정 세포 유형 효율적 셀 어레이를 형성하지 않을 여전히 가능하다. 아니 셀 어레이 형성하면, DNA 시약의 높은 농도는 더 나은 셀 어레이 형성을 얻기 위하여 동일한 프로토콜을 수행하도록 권장한다.

제약 산업에서의 최근의 진보는 종양 세포 항체 및 개인화 된 암 치료의 특정 식별을 실현하는데 관심이 높아진있다; 그러나, 여러 가지 장애물 공정에서 발생된다. 전임상 개발에 항암 활성을 에이전트의 단 5 %의 단계 II-III 시험 1, 2에 충분한 효능을 표시 한 후 라이센스가 부여됩니다. 많은 예제 인해 서로 다른 혈액 성분 3-5 그 항 종양 약물은 인간에 주로 실험 동물에 다르게 동작 보여 주었다으로 임상 전략 (생체 외 및 생체 내) 최적입니다. 항암 약물 스크리닝 플랫폼의 필요성을 해결하기 위해 비싼 동물 실험 및 임상 시험 전에 체크 포인트를 제공하기 위해, 인간 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 더욱 중요한 생물학적 환경에서 항 종양 약물의 효능을 평가하기 위해 제안된다.전혈 세포 독성 분석은 항체 및 인간 전혈의 다른 약물 후보 개별 세포의 반응을 평가할 수있다. WCA는 높은 처리량과 높은 함량 촬상 6 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발된다. 자동화 된 이미징 시스템을 이용하여 모두 거실과 사균의 수는 고정밀 도로 측정 할 수있다. 인해 표적 세포가 동일한 초점 평면 상에 고정된다는 사실 때문에, WCA는 적혈구의 제거없이 실시간 정량적 세포 독성 분석을 제공 할 수있다. 또한, 자동 촬상 시스템은 그 특정 기준에 도달 한 경우에만 표적 세포 (예., 형광 표지 된 세포 및 세포 형태) 등의 여러 가지 이점 게이팅되고 처리를 제공한다. 또한, 하루에 144 판의 생산을 허용한다. 결과적으로,이 영상 능력과 처리량이 높은 C의 실행을 허용ontent 동시에 높은 처리량 실험. WCA 및 자동화 된 이미징 시스템을 조합함으로써, 높은 처리량 정량 세포 독성 분석은 더욱 중요한 생물학적 환경에서 달성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Cell attachment 96 well plate kits&amp;nbsp;</td><td>Adheren</td><td>AP9601</td><td></td></tr><tr><td>Suspension Single cell array 8 well chamber slide</td><td>Adheren</td><td>SS0801</td><td></td></tr><tr><td>Adherent Single cell array 8 well chamber slide</td><td>Adheren</td><td>SS0802</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoma cell line CD20+</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Raji cells</td></tr><tr><td>Lymphoma cell line CD20-</td><td>ATCC</td><td>CRL-8083</td><td>MC/CAR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo</td><td>SH30070.01HI</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Cytosolic dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Cell Tracker Green</td></tr><tr><td>Rituxan (Biosimilar)&amp;nbsp;</td><td>Eureka Therapeutics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human whole blood</td><td>Allcells</td><td>WB001</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Automatic imaging system</td><td>Molecular Devices</td><td>Contact Vendor</td><td>Cell Reporter</td></tr><tr><td>Cell counting program</td><td>Molecular Devices</td><td>Contact Vendor</td><td>Cell Reporter</td></tr></tbody></table>

real-time cytotoxicity assays in human whole blood

전반적인 세​​포 독성의 시간 정보에 대한 액세스를 허용 생균 기반 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 높은 처리량 셀 측위 기술 개발된다. 표적 종양 세포 인구 먼저 배열 형식으로 고정화에 미리 프로그램 및 녹색 형광 세포질 염료로 표시되어 있습니다. 셀 어레이의 형성에 이어, 항체 약물은 인간 전혈과 조합하여 첨가한다. 요오드화 프로피 듐 (PI)는 다음 세포 사멸을 평가하기 위해 첨가된다. 셀 어레이는, 자동 촬상 시스템으로 분석된다. 세포질 염료를 대상으로 종양 세포 인구 레이블하지만, PI는 죽은 종양 세포 인구 레이블. 따라서, 표적 암 세포의 사멸 율은 죽은 표적 세포의 수에 표적 세포 생존 수를 계산함으로써 정량화 할 수있다. 이 방법으로, 연구자들은 시간 의존적 농도 의존적​​ 세포 독성 정보에 액세스 할 수있다. 놀랍게도, 유해 라디오 없다화학 물질이 사용된다. 여기에 제시된 WCA는 림프종, 백혈병 및 고형암 세포주에서 테스트되었습니다. 따라서, WCA는 연구자가 관련성이 높은 생체 조건에서 약물의 효능을 평가할 수 있습니다.

항 CD20 항체 및 림프종 세포 (라지 세포 및 MC / CAR)은 전혈 세포 독성 분석 (WCA) 7,8 입증하는 모델 시스템으로 선택되었다. MC / CAR 세포들은 멤브레인 CD20 낮은 카피 수 있었는 라지 세포는 세포 표면 상 CD20의 높은 카피 수 있었다. 표적 세포는 먼저 녹색 형광 세포질 염료 녹색 염색 96 웰 플레이트에 배열했다. 10000 - 50000 림프종 표적 세포를 각 웰에 고정화 하였다. 갓 그린 인간 전혈 180 ㎕를 각 웰에 첨가 하였다. 항 CD20 항체는 농도 구배 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가 하였다. 37 ° C에서 16 시간 배양 한 후, 세포 수는 녹색 형광 세포 및 적색 형광 세포의 수를 분석하여 자동 화상 카메라를 통해 정량적으로 평가 하였다. 림프종 표적 세포가 모두 동일한 초점 평면 상에 배열 되었기 때문에, 각 셀의 형광도 레모 않고 직접 검출되었다웰에 혈구 ving. 도 1에 도시 된 바와 같이, (건재 죽은 모두) 대상 라지 림프종 세포의 검출을 행 하였다. 도 1에서 녹색 점 제시된 표적 세포의 수를 나타내었다. 그들은 PI와 형광 빨간색 염색 때문에 그림 1의 죽은 세포 (붉은 점)은 적색 형광의 강도를 정량적으로 분석 하였다. 항체의 세포 독성은 (녹색 점) 제시 세포에 죽은 세포의 비율 (모두 녹색과 빨간색 염색)을 통해 분석 하였다. 항 CD20 항체의 농도가 감소 된 농도로 형광 빨강 점의 수는 감소 하였다. 각 항체 농도는 삼중 독립적으로 시험 하였다. 각 항체 농도를 들어, 웰 당 400 개 이상의 표적 세포는 평균값 및 세포 독성 결과의 표준 편차를 제공하도록 묘화 하였다. 400 데이터 포인트 체육와 함께, 우리의 데이터를 바탕으로r에 항체 농도, 우리는 p 값 &lt;0.01로 통계 결과를 얻었다. 용량 의존적 마약 효율은도 2를 얻었다. CD20 항원의 낮은 카피 수와 MC / CAR 세포 제어 세포주로 사용 하였다. 0.12 ㎍ / ㎖가 EC (50) 값은 보체 의존성 세포 독성 분석 (CDC) 또는 항체 의존성 세포 독성을 포함한 정규 항체의 세포 독성 분석에서 얻은 값 범위 내에 라지 림프종 세포, 대 WCA 결과 (용 얻었다 ADCC) 분석. 9-11 <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51941/51941fig1highres.jpg" width="500" /> 도 1. 항체 기반 세포 독성은 전혈에서 측정. 라지 세포는 녹색 세포질 염색으로 표지 한 후 고정화 하였다. PI는 세포 사멸에 접근시켰다. 죽은 세포는 PI로 빨간색 염색 하였다. 다양한 정광항 CD20 항체의 이온은 전혈의 추가로 첨가 하였다. (a) 2.5 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후에, (b) 1 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후에, (c) 0.5 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후, (d)는 0.25 μg의 / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후에, (예) 0.1 μg의 후 / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간 후 (f)를 0.05 ㎍ / ㎖의 항 CD20 항체를 16 시간, (g) 2.5 μg의이 ml의 항체 제어 / 16 시간 후. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51941/51941fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 인간의 전체 혈액에 다른 세포주에 대하여 2. 용량 의존적으로 세포 독성. 라지는 CD20 양성 림프종 세포, 그리고 MC / CAR는 CD20 부정적인 세포주이었다. 전혈 세포 독성 수준은 α-CD20 항체 (항 CD20 항체)의 서로 다른 농도에 대해 도시 하였다.

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Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

real-time-cytotoxicity-assays-in-human-whole-blood

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

12.1K 조회수.  Adheren, Inc.  전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다. 

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Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes more complex, the goal of targeting mitochondria using various compounds that inflict mitochondrial damage (so-called mitocans) is becoming quite popular. Unfortunately, many existing cytotoxicity assays, such as those based on tetrazolium salts or resazurin require functional mitochondrial enzymes for their performance. The damage inflicted by compounds that target mitochondria often compromises the accuracy of these assays. Here, we describe a modified protocol based on differential staining with two fluorescent dyes, one of which is cell-permeant (Hoechst 33342) and the other of which is not (propidium iodide). The difference in staining allows living and dead cells to be discriminated. The assay is amenable to automated microscopy and image analysis, which increases throughput and reduces bias. This also allows the assay to be used in high-throughput fashion using 96-well plates, making it a viable option for drug discovery efforts, particularly when the drugs in question have some level of mitotoxicity. Importantly, results obtained by Hoechst/PI staining assay show increased consistency, both with trypan blue exclusion results and between biological replicates when the assay is compared to other methods.

The protocol describes a rapid, high-throughput, reliable, inexpensive, and unbiased assay for efficiently determining cellular viability. This assay is particularly useful when cells&#39; mitochondria have been damaged, which interferes with other assays. The assay uses automated counting of cells stained with two nuclear dyes &#8211; Hoechst 33342 and propidium iodide.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

암 연구학

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

<meta charset="utf8"></head><body>진균 및 바이러스 면역 분석을 위해 최적화된 전혈 면역분석법

Whole Blood Assay with Dual Co-Stimulation for Antigen-Specific Analysis of Host Immunity to Fungal and Viral Pathogens

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of advanced antigen-specific immunoassays. Traditionally, such immunoassays, especially antigen-specific T-cell analysis by flow cytometry or enzyme-linked immunosorbent spot assays, often rely on the isolation of peripheral blood mononuclear cells. This process is time-consuming, subject to many pre-analytic confounders, and requires large blood volumes. Whole blood-based assays provide a facile alternative with increased pre-analytic robustness and lower blood volume requirements. Furthermore, whole blood-based assays allow for the preservation of inter-cellular interactions that are not captured by assays using isolated cell subsets. Recently, a refined whole blood immunoassay with dual anti-CD28 and anti-CD49d co-stimulation for comprehensive analysis of both antigen-specific T-cell functions and complex intercellular interactions in response to various fungal and viral antigens has been proposed. This protocol provides guidance for the preparation of stimulation tubes, blood stimulation, and downstream sample processing for flow cytometry, cytokine secretion assays, and transcriptional analyses. This includes a validated and functionally equivalent, previously unpublished, low-volume protocol (250 &#181;L) to make flow cytometric and cytokine-based T-cell monitoring more accessible for studies in pediatric patients or preclinical studies in small animals (e.g., mice). Altogether, these protocols provide a versatile toolbox for complex antigen-specific immune analysis in both clinical and translational research settings.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Advancing Immune Monitoring in Critical Care Patients Using Whole Blood Assays (전혈 분석을 사용한 중환자 치료의 면역 모니터링 발전)

Whole blood-based immunoassays provide a facile and resource-efficient tool to analyze antigen-specific immunity for diagnostic and research purposes. This article provides an optimized whole blood-based protocol with dual co-stimulation for comprehensive analysis of host immunity to fungal and viral pathogens, including a low-volume version for pediatric patients and small animals.

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of ...

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

요약

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xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석