신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 선택적 유전자 및 약물 전달 도구의 개발은, 세포 표적화의 정량화 및 특성화를 요구하며, 재투여 시, 또는 바이러스 벡터, 또는 나노입자. 그들은 유세포 측정의 처리량 및 멀티플렉스 기능을 가지고 있으며, 마우스 뇌와 척수에서 여러 세포 유형을 간단하고 동시에 식별할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 알렉산더 연구소의 포스트 닥터인 프란시스코 하비에르 몰리나 에스테베스입니다.
8주된 C57 Black 6 마우스에서 뇌와 척수를 수확한 후, 얼음 위에 잘 얼음으로 차가운 HPSS 2밀리리터가 들어 있는 6웰 플레이트의 개별 우물에 조직을 배치합니다. 수확한 각 조직을 두 개의 동등한 조각으로 나눕니다. 가위를 사용하여 각 조직 샘플의 절반을 1~2밀리미터 두께의 조각으로 다진다.
모든 조직이 단편화되면 HPSS에서 수정된 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 미리 헹구고 파이펫을 사용하여 각 조직 현탁액을 개별 15 밀리리터 원문 튜브로 옮기습니다. 우물당 2밀리리터를 추가로 헹구면 우물을 헹구어 보입니다. 그리고 해당 15 밀리리터 원판 튜브에서 세초를 당깁니다.
원심분리에 의한 샘플을 퇴적시합니다. 그리고 신경 조직 해리 키트에서 효소 P 50 마이크로리터를 샘플 당 키트에서 버퍼 X 1, 900 마이크로리터와 혼합합니다. 효소 믹스를 섭씨 37도에서 적어도 10분간 데우습니다.
그리고 각 조직 수집 튜브에서 슈퍼 나티를 흡인. 효소 혼합물이 준비되면 각 샘플에 1.95 밀리리터의 용액을 추가하십시오. 그리고 부드럽게 소용돌이가 다시 펠릿을 중단합니다.
다음으로, 휠의 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 효소 A의 마이크로리터 10을 샘플당 버퍼 Y 20 마이크로리터와 혼합합니다. 두 번째 효소 용액을 섭씨 37도에서 미리 떼어내면 흔들리는 배양 끝에 각 조직 용액에 30 마이크로리터를 추가합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 HPSS로 미리 헹구어 각 샘플을 부드럽게 혼합합니다.
그리고 37섭씨에서 15분 동안 시편을 휠로 되돌려 보입니다. 인큐베이션이 끝나면 얼음처럼 차가운 HPSS 10밀리리터로 효소 반응을 체포합니다. 그리고 원심분리에 의한 샘플을 퇴적시한다.
원심분리가 끝나면 튜브당 7밀리리터의 얼음-차가운 HPSS로 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 얼음에 튜브를 들고 전에, 부드럽게 각 샘플을 소용돌이. 조직 균질화를 위해, 미리 냉각된 HPSS의 3밀리리터를 투온스 조직 분쇄기의 미리 차가운 유리 박격포에 추가하고 수확한 뇌 또는 척수 조직 샘플 중 하나의 후반을 박격포로 옮긴다.
부드럽게 페슬 A의 10 스트로크로 조직을 메이케레이트, 다음 10 페슬 B.의 스트로크와 새로운 15 밀리리터 원판 튜브로 균질화 혼합물을 전송. 원심분리를 위해 미리 냉각된 HPSS로 10밀리리터의 최종 부피로 튜브를 채웁니다. 그리고 얼음에 샘플을 개최하기 전에, 소용돌이와 신선한 HPSS의 일곱 밀리리터에 펠릿을 다시 중단합니다.
이물질 제거의 경우, 소화된 각 시료 또는 균질화된 각 시료에 미리 냉각된 동위원 용액 3밀리리터를 추가합니다. 그리고 샘플을 부드럽게 소용돌이쳐 균일하게 혼합되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 샘플을 원심 분리하고, 조심스럽게 용액의 표면에 떠있는 파편과 myelin의 희끄무레한 디스크를 제거합니다.
파편이 버려지면 펠릿을 방해하지 않고 각 튜브에서 수퍼나티의 마지막 100 마이크로리터를 제외한 모든 것을 수집하십시오. 개별 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 전송하기 위해 FACS BL 솔루션의 1 밀리리터로 각 펠릿을 다시 중단합니다. Percoll 솔루션과의 통합 후, 샘플 손실을 피하기 위해 셀 펠릿을 손상시키지 않고 파편 디스크와 상체를 매우 신중하게 제거하는 것이 중요합니다.
원심 분리 후 각 튜브에서 상류체를 조심스럽게 흡인하고 튜브 당 350 마이크로 리터의 펠릿을 다시 중단하십시오. 격리된 세포 유형의 유량 세포 측정 분석을 위해, 표에 설명된 서 프로토콜에 따라 각 튜브에 적절한 항체를 추가하기 전에 튜브당 FC 블록당 5마이크로그램의 샘플을 4도에서 10분 동안 배양한다. 혼합하는 5 초 동안 각 튜브를 소용돌이.
그리고 빛으로부터 보호 15 분 동안 섭씨 4도에 샘플을 배치합니다. 인큐베이션의 끝에서, 튜브 당 PBS의 1 밀리리터와 원심 분리기로 샘플을 씻어. 튜브 당 스트렙타비딘의 적절한 부피에서 펠릿을 다시 중단합니다.
소용돌이가 섞인 후, 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 그리고 입증 된 바와 같이 튜브 당 PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻어. 수퍼네이츠를 폐기한 후, 튜브당 300마이크로리터의 펠릿을 다시 중단한다.
그리고 7-AAD의 5 개의 마이크로 리터로 각 샘플을 라벨. 그런 다음 시토플루오로메트릭 분석까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 균질화 방법은 전체적으로 뇌와 척수 모두에서 더 높은 세포 수율을 생성하지만, 검색 된 세포의 대부분은 일반적으로 죽었으며 뇌에서 실행 가능한 세포의 약 14 %가 치유되고 척수에서 약 10 %가 치유됩니다.
대조적으로, 파팡 소화 방법은 세포 생존성의 전반적인 더 나은 보존귀착됩니다. 9색 이중유 세포측정을 가진 뇌 및 척수 세포 현탁액을 분석하면 CD45+CD11b+microglia 및 대식세포의 존재를 알 수 있습니다. 그리고 두 조직에서 CD45+CD11b-림프구.
CD45 세포 인구는 성상세포, 또는 올리고덴드로시테 마커, 또는 야피및 내피 표면 마커 발현에 대한 양성에 따라 차별될 수 있다. 균질화 방법을 사용하여, 실행 가능한 세포의 32 ~38%는 조혈 기원이다. 효소 소화 방법은 비 조혈 CD45 세포의 매우 큰 분수의 획득을 초래하는 동안.
놀랍게도, CD45+CD11b+마이크로글리아 및 대식세포는 균질화 방법을 사용하여 가장 풍부한 실행 가능한 세포 분획을 나타냅니다. 그러나 소화 방법은 성상세포, 올리고덴드로키테, 내피 세포 및 뉴런을 포함한 세포 유형의 보다 이질적인 표현을 생성합니다. 이 프로토콜은 다재다능하며 특정 세포 하위 집단, 1차 배양 또는 생화학적 또는 RNA 염기분석과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에 대해 악용될 수 있다.
우리는 이 진행 도중 또는 내위축성 측삭 경화증의 마우스 모형에 있는 처리 후에, 또는 다른 CNS 인구의 유전자 발현 그리고 기능적인 서명을 평가하기 위하여 이 프로토콜을 실행했습니다.
