말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

이 연구는 동기화된 심전도 기록과 함께 생체 내 칼슘 이미징을 위해 마취된 마우스에서 흉부 DRG를 노출시키는 외과적 조작을 도입했습니다. 이를 통해 우리는 PC6 구멍의 침술이 DRG 뉴런을 활성화하고 동시에 심전도를 조절할 수 있는지에 대한 답을 얻으려고 합니다. 현재 침술 연구에 사용되는 기술로는 생체 내 또는 체외 전기생리학, 신경 추적, 광유전학 및 화학유전학과 결합된 다양한 전략 등이 있습니다.

이 연구에서 소개된 생체 내 칼슘 이미징은 동적, 실시간 기록을 통해 다양한 동물 모델에서 침술에 의해 유도된 DRG 뉴런 집단의 활동을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다. 흉추 1-5개의 척추 분절에서 흉추의 생리학적 만곡으로 인해 흉추 DRG는 노출하기가 매우 어렵습니다. 게다가, 심장 및 폐 리듬의 영향으로 인해 흉부 DRG의 고정이 어렵습니다.

그렇지 않으면 호흡기 마취와 몇 시간 동안 마우스의 상태 유지가 쉽지 않습니다. 생체 내 칼슘 이미징은 유전 공학 마우스를 사용하여 특정 뉴런 집단의 활동을 보여줍니다. 흉부 DRG 뉴런이 생체 내에서 관찰된 것은 이번이 처음입니다.

이 접근법은 신체 또는 내장 자극에 의해 생성되는 신경 활동과 누화에 대한 관찰을 실현합니다. 본 연구실에서는 흉추 및 요추 DRG의 체내 칼슘 이미징 방법을 확립했으며, 향후 침술의 시작 요인, 과민증, 체세포 침술 자극 및 내장 입력 간의 상호 작용과 관련된 수용체를 검토할 것입니다. 마취된 마우스에서 기관절개술을 시행한 후 가열된 패드 위에 마우스를 엎드린 자세로 놓습니다.

목덜미 중앙을 2cm 길이로 절개하여 경추 6개에서 흉추 3개까지 연장합니다. 생쥐의 흉추 앞쪽에 있는 지방샘과 동면하는 땀샘을 조심스럽게 분리하고, 땀샘 아래의 혈관을 피한다. 스프링 가위를 사용하여 승모근을 포함한 피부와 근육층을 자릅니다.

추가 노출을 돕기 위해 근육 사이에 견인기를 삽입하십시오. 머리 클램프에 부착 된 근육과 긴 목 근육의 곧은 부분을 제거하여 흉부 2의 가시 돌기를 노출시킵니다. 척추궁(semispinalis)과 척추근(spinalis muscle)을 변위시켜 척추궁(vertebral arch)을 C6에서 T3로 노출시킨다. 척추궁판(vertebral arch plate)과 흉곽(thoracic arch plate)의 관절돌기(articular process) 사이의 연결을 끊는다.

가는 집게를 사용하여 흉부 관절의 좌우 관절 돌기와 유방 돌기를 꼼꼼하게 제거합니다. 위에 있는 결합 조직을 제거합니다. 왼쪽 또는 오른쪽 흉부 신경절 또는 DRG를 조심스럽게 노출시켜 선택한 쪽에서 상근의 무결성을 보장합니다.

노출된 DRG 위에 따뜻한 식염수에 적신 작은 면봉을 올려 수분을 유지합니다. ECG 모니터를 오른쪽 상지의 음극, 오른쪽 하지의 접지선, 왼쪽 하지의 양극에 연결합니다. 맞춤형 척추 클램프의 스테이지에 마우스를 놓습니다.

경추 6과 흉부 3의 관절 과정에 부착된 두 개의 클립을 사용하여 마우스를 고정합니다. 척추 cl을 배치합니다.amp 컨포칼 현미경 아래에 고정된 마우스와 함께. 노출된 흉부 10 DRG 위에 0.32x/0.32 긴 작동 거리 공기 대물렌즈를 놓습니다.

단계 크기를 25마이크로미터로 설정하고 해상도를 512 x 512 또는 1, 024 x 1, 024 픽셀로 설정합니다. 스테이지 z축을 위아래로 조정하고 전체 흉부 1 DRG를 캡처합니다. 마우스의 상지에 브러시 자극을 가하고 이미징된 DRG 뉴런의 반응성을 평가합니다.

자극기를 사용하여 PC6 자극에서 말초 신경 자극을 수행합니다. 기준선 조건에서 흉부 1 DRG의 대부분의 뉴런은 GFP 형광을 나타내지 않았습니다. 체세포 자극은 GFP의 수와 강도의 증가와 함께 GCaMP 형광의 빠르고 일시적인 증가를 초래했습니다.

PC6 적용에서 말초 신경 자극은 체세포 자극과 유사한 GCaMP 형광 변화를 초래했습니다. 뉴런은 이미징 소프트웨어로 추적한 후 단일 흉부 1 DRG 내에서 표시되고 번호가 매겨졌습니다. F0 역치의 130%를 초과하는 형광 강도 변화를 보이는 뉴런은 양성 반응으로 간주되었습니다.

히스토그램은 PC6에서 말초 신경 자극에 반응하는 뉴런의 다양한 직경을 표시했습니다. PC6 자극에서 말초 신경 자극은 심박수가 증가한 것으로 나타났습니다.