Rozmieszczenie naukowców w celu przeprowadzenia nieniszczących próbek genetycznych rzadkich populacji motyli

Summary

Tutaj prezentujemy prosty protokół nieinwazyjnego pobierania próbek genetycznych populacji motyli na podstawie zbierania w terenie resztek jaj. Może być używany do potwierdzania tożsamości gatunku i ilościowego określania zmienności genetycznej. Protokół ten można łatwo dostosować do szerszych grup w celu zaangażowania społeczności w naukę.

Abstract

Globalne spadki liczebności owadów nadal przyspieszają. Skuteczne pobieranie próbek genetycznych jest niezwykle potrzebne, aby pogłębić wiedzę na temat wielu taksonów i wypełnić istniejące luki w wiedzy. Protokół ten stanowi zademonstrowaną metodę nieniszczącego pobierania próbek rzadkich motyli pod kątem struktury genetycznej populacji lub analiz kodów kreskowych DNA. Wykorzystuje kosmówkę wyklutych komórek jajowych motyli w celu uzyskania wystarczająco dużej ilości i jakości DNA, aby umożliwić pomyślne sekwencjonowanie genów w celu potwierdzenia tożsamości gatunku i ilościowego określenia zmienności genetycznej. Może to być szczególnie przydatne, gdy inne techniki pobierania próbek tkanek są niepraktyczne lub niedostępne. Chociaż został opracowany dla lepidoptera, może być jednak łatwo przystosowany do użytku z innymi gatunkami owadów. Został specjalnie zaprojektowany z myślą o łatwości użycia jako cel, aby pomóc zmaksymalizować szerokie wdrożenie przez osoby o różnym doświadczeniu i poziomie umiejętności, takie jak naukowcy społeczni, praktycy ochrony przyrody i studenci, oraz do użytku na dużych obszarach geograficznych w celu ułatwienia szerokiego pobierania próbek populacji. Uzyskane dane mogą pomóc w podejmowaniu decyzji taksonomicznych i dotyczących sporządzania wykazów, działań w zakresie ochrony i zarządzania, a także w usprawnieniu podstawowych badań ekologicznych.

Introduction

Efektywne pobieranie próbek genetycznych populacji rzadkich, malejących i/lub wymienionych taksonów owadów jest często kluczowe dla informowania o działaniach ochronnych i zarządczych. Metody pobierania próbek tkanek powodujących śmierć lub uszkodzenie są rutynowo stosowane w wielu analizach genetycznych. Jednak metody te są niepożądane lub niedozwolone, ponieważ mogą wyrządzić szkodę wrażliwym istniejącym populacjom lub negatywnie wpłynąć na zachowanie i sprawność. Różne nieśmiercionośne lub nieinwazyjne techniki pobierania próbek obejmujące tkanki, takie jak całe nogi, wycinki czułków lub skrzydeł, wysięki larwalne lub hemolimfy z wydzielin obronnych i inne produkty, takie jak frass, są odpowiednie do badań genetycznych owadów^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}. Ogólna wykonalność i możliwość zastosowania tych różnych technik pobierania próbek tkanek różni się znacznie w zależności od biologii, ekologii, zachowania, wielkości i rzadkości organizmu ogniskowego, sytuacji i osób zbierających materiał. Na przykład wycinki całych nóg lub wyrostków wymagają tymczasowego schwytania i ostrożnego obchodzenia się z kilkoma osobnikami na odpowiednim etapie życia, zazwyczaj przez doświadczony personel. Podobnie, źródła tkankowe, takie jak wysięki larwalne lub frass, mogą być praktyczne tylko wtedy, gdy organizmy są w niewoli lub tymczasowo przetrzymywane przez odpowiedni okres.

Dla pytań badawczych zadawanych na poziomie populacji, takich jak te dotyczące potencjalnego zróżnicowania taksonomicznego lub struktury genetycznej, często wymagane jest pobieranie próbek w szerszej skali czasowej lub geograficznej (tj. regionalnej lub kontynentalnej). W rezultacie, niektóre nieinwazyjne źródła tkanek mogą być całkowicie niepraktyczne lub co najmniej nieefektywne w zbieraniu w dużych ilościach. Pobieranie próbek na taką skalę może być dodatkowo logistycznie lub finansowo niepraktyczne lub zaporowe dla indywidualnych badaczy, a nawet mniejszych zespołów terenowych. Podczas gdy bezpośrednie zaangażowanie naukowców ze społeczności jest coraz częściej przyjmowane przez społeczność badawczą, aby pomóc w sprostaniu wielu z tych wyzwań i przyspieszyć gromadzenie dużych zbiorów danych, przyjęcie było ograniczone w przypadku badań obejmujących nieniszczące, nieinwazyjne lub pobieranie próbek eDNA^10,11,12.

Aby pomóc przezwyciężyć niektóre z tych potencjalnych ograniczeń, wykazaliśmy, że kosmówka z wyklutych jaj motyli może dostarczyć wystarczająco dużo i jakości DNA, aby pomyślnie sekwencjonować geny, aby potwierdzić tożsamość gatunku i określić ilościowo zmienność genetyczną. Następnie przetestowaliśmy różne protokoły zbierania przy użyciu tej techniki¹³. Prace pilotażowe posłużyły jako podstawa do dalszych udoskonaleń metodologicznych. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje wynikający z tego prosty, ale kompleksowy, poprawiony protokół zbierania danych w terenie, który został wdrożony dla naukowców społecznych i innego personelu niebędącego ekspertami. Protokół ten jest częścią obejmującej cały zakres analizy struktury populacji oszronionego motyla elfa (Callophrys irus), która ma pomóc w informowaniu o przyszłych działaniach ochronnych i federalnej decyzji o ewentualnym umieszczeniu na liście gatunków zagrożonych wyginięciem w Stanach Zjednoczonych. Chociaż potencjalnie jest to bardziej pracochłonne niż niektóre metody nieinwazyjne, brak niezbędnego kontaktu z organizmami i łatwość użycia sprawiają, że jest to potencjalnie opłacalny model, który może być zastosowany w innych programach badań genetycznych populacji ukierunkowanych na wybór zarówno owadów pospolitych, jak i tych budzących obawy o ochronę, które pozostawiają resztki jaj po niedawno wyklutych nimfach lub larwach. Przedstawiony tutaj język protokołu został opracowany specjalnie dla motyli z rodziny Lycaenidae i do użytku przez osoby niebędące ekspertami, zdefiniowane tutaj jako naukowcy społeczni lub inne osoby (np. biolodzy agencyjni, stażyści) z ograniczonym doświadczeniem entomologicznym.

Protocol

1. Rozpowszechnianie materiałów dla naukowców społeczności

1. Dokładnie przejrzyj i zgromadź pełną listę potrzebnych materiałów związanych ze zbiórką, zapoznając się z pełną tabelą materiałów.
2. Jeśli pobieranie próbek będzie odbywać się w wielu lokalizacjach i/lub przez wiele osób/zespołów, zgromadź i zorganizuj wszystkie potrzebne zapasy w oddzielnych jednostkach do rozmieszczenia (Rysunek 1 i Rysunek 2).
3. Zaopatrzenie transportowe (jednostki zdolne do rozmieszczenia) dla naukowców społecznych lub innego personelu odpowiedzialnego za zbieranie danych w terenie.
4. Jeśli personel nie jest lokalny, ostrożnie zapakuj zapasy (każdą mobilną jednostkę) do osobnego kartonowego pudełka wysyłkowego z kompletną etykietą wysyłkową i wyślij.
   UWAGA: Na tym etapie przyspieszona wysyłka nie jest wymagana.

2. Przygotowanie kolekcji dla naukowców społeczności

1. Po otrzymaniu materiałów do zbiórki, w tym skrzynki na zbiórkę, należy dokładnie przejrzeć laminowaną listę dostaw i przeprowadzić pełną inwentaryzację. Powiadom lidera projektu, jeśli brakuje jakichkolwiek zapasów.
2. Napełnij probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml 180 μl buforu do lizy, naklej etykiety z nadrukowaną unikalną etykietą identyfikacyjną na każdą probówkę do mikrowirówki i umieść wszystkie probówki w 64-dołkowym pojemniku do przechowywania probówek do mikrowirówek. Mocno zabezpiecz pokrywę po załadowaniu.
   UWAGA: Jeśli drukarki etykiet nie są dostępne, nanieś unikalne numery identyfikacyjne na bok i wieczko każdej fiolki za pomocą markera odpornego na obecność etanolu.
3. Upewnij się, że wszystkie urządzenia cyfrowe (np. smartfon lub aparat fotograficzny) są w pełni naładowane, a wszelkie zapasowe baterie są zapakowane.
4. Częściowo napełnij małą lodówkę lodem do przechowywania w terenie i lokalnego transportu pobranych próbek.
5. Zapakuj wszystkie materiały do zbiórki do pojemnika na odpady lub podobnego solidnego, odpornego na warunki atmosferyczne pojemnika, aby zapewnić bezpieczny transport i skonsolidowane przechowywanie.
6. Zapoznaj się ze szczegółowym protokołem nieniszczącego pobierania próbek genetycznych przed wyruszeniem w teren.
   UWAGA: Skorzystaj z laminowanego i skondensowanego, ilustrowanego protokołu, aby uzyskać dodatkowe wskazówki w terenie (rysunek uzupełniający S1 i rysunek uzupełniający S2).

3. Pobieranie próbek w terenie

1. Po przybyciu na teren pola użyj ołówka lub długopisu na każdą pogodę, aby zapisać w odpornym na warunki atmosferyczne zeszycie polowym porę dnia, datę, ogólną nazwę nieruchomości (np. Las Narodowy Apalachicola), nazwę lub opis konkretnej lokalizacji terenowej oraz odczyt GPS, jeśli jest dostępny, a także pełne imię i nazwisko oraz role wszystkich obecnych osób.
2. Zlokalizuj odpowiednie siedlisko, w którym występują larwy gatunków roślin żywicielskich charakterystycznych dla docelowego motyla.
   UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uniknąć lub zminimalizować wpływ na wrażliwe siedliska, populacje roślin i dziką przyrodę. Ponadto należy upewnić się, że zabezpieczyłeś wszystkie odpowiednie uprawnienia i/lub pozwolenia właściciela gruntu przed uzyskaniem dostępu do terenu i wydarzeń związanych z pobieraniem próbek.
3. Za pomocą smartfona lub aparatu fotograficznego wykonaj szczegółowe zdjęcia wszystkich miejsc polowych, miejsc pobierania próbek, roślin żywicielskich i wszelkich innych informacji, które mogą być istotne dla projektu. Używaj smartfonów lub innych aparatów, które rejestrują współrzędne GPS.
   UWAGA: Geotagowanie zdjęć musi być włączone na wszystkich smartfonach.
4. Kompleksowo przeszukaj wszystkie larwalne części roślin żywicielskich, takie jak liście, pąki kwiatowe, kwiaty lub rozwijające się owoce, o których wiadomo, że są wybierane przez składanie jaj przez składanie jaj przez składanie jaj przez dorosłe samice motyli. W przypadku większości Lycaenidae szukaj białych, wyklutych jaj z wyraźnym otworem w środku przypominającym pączka, z którego wyłoniła się larwa noworodka (Ryc. 3). Szukaj niewyklutych jaj, które mają nieco ciemniejszy kolor, często zielony lub niebieskawy i będą całkowicie nienaruszone bez w środku (Rysunek 4). Użyj soczewki ręcznej lub innego urządzenia powiększającego, aby dokładnie przyjrzeć się każdemu jaju.
5. Po zlokalizowaniu wyklutego jaja załóż rękawiczki nitrylowe na obie ręce.
6. Za pomocą czystych, sterylnych, spiczastych kleszczy chwyć i delikatnie wyciągnij wyklute jajo z rośliny żywicielskiej i umieść je bezpośrednio w oznakowanej probówce do mikrowirówki wypełnionej buforem do lizy pobranej z 64-dołkowego pudełka do przechowywania.
   UWAGA: Niektóre materiały przenoszone przez rośliny żywicielskie (o średnicy mniejszej niż 15 mm) są dopuszczalne i normalne podczas zbioru.
7. Zebrać co najmniej 5 próbek na grządkę/miejsce uprawy żywicielskiej (każda zawierająca od 1 do 20 wyklutych jaj), dążąc do uzyskania łącznie >50 jaj w miejscu, jeśli jest to możliwe.
   UWAGA: Pomoże to upewnić się, że przynajmniej część tkanki zostanie pobrana z każdej próbki, rośliny/plastra i zwiększy szanse na wykrycie DNA (osobista obserwacja).
8. Po każdym pobraniu jaj należy dokładnie oczyścić końcówki kleszczy, zanurzając je w fiolce zawierającej 95% etanol lub oblewając 95% etanolem z wyciskanej butelki lub używając chusteczek nasączonych alkoholem.
   UWAGA: Pomoże to zminimalizować przenoszenie tkanek między zdarzeniami pobierania próbek.
9. Jeśli to możliwe, zbierz kilka wyklutych jaj (1-20 jaj) z wielu roślin w tym samym plastrze żywiciela do jednej probówki do mikrowirówki i mocno zamknij pokrywę. W przypadku gatunków motyli wykorzystujących większe zielne lub drzewiaste gatunki żywicielskie, zbierz wiele jaj z różnych miejsc na tej samej roślinie, jeśli plamy żywiciela są ograniczone.
   UWAGA: Rośliny znajdują się w tym samym żywicielu, jeśli ich liście stykają się ze sobą. Jeżeli istnieje zauważalna fizyczna separacja między roślinami lub płatami, należy ją uznać za inną próbkę. W przypadku pobierania innego rodzaju tkanki, takiej jak wysięki larwalne lub pojedyncza noga, należy umieścić tylko jedną nogę, fragment nogi lub wysięk larwalny w probówce do mikrowirówki (jedna próbka na osobę).
10. Upewnij się, że cały zebrany materiał jest całkowicie zanurzony w buforze do lizy w każdej probówce mikrowirówki o pojemności 1.5 ml. Postukaj dnem danej rurki o twardą powierzchnię, aby w razie potrzeby ponownie zanurzyć próbki.
11. Wytrzyj kleszcze do wyschnięcia czystą jednorazową chusteczką laboratoryjną.
    UWAGA: Staranne czyszczenie kleszczy jest niezbędne, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami.
12. Podczas pobierania nowej próbki należy wyrzucić zużyte rękawice nitrylowe i zastąpić je czystą parą.
13. W odpornym na warunki atmosferyczne zeszycie polowym użyj ołówka lub długopisu na każdą pogodę, aby zapisać unikalną etykietę identyfikacyjną przypisaną z probówki do mikrowirówki wraz z rodzajem próbki (np. jaja, wysięki larwalne lub noga), przybliżoną liczbą wyklutych jaj oraz informacjami o kolekcji, takimi jak nazwa (imiona) i nazwisko (nazwiska) zbieracza, data, lokalizacja, gatunek rośliny żywicielskiej i wszelkie dodatkowe uwagi (Rysunek 2).
14. Umieść zamkniętą probówkę wirówkową z próbką resztek jaj z powrotem w 64-dołkowym pojemniku do przechowywania mikrowirówek.
15. Przechowuj 64-dołkowy schowek na mikrowirówkę w chłodziarce z lodem podczas pracy w terenie.
16. Utrzymuj wszystkie inne zapasy zbiórki w skrzynce odbiorczej podczas przebywania w terenie, aby zapewnić bezpieczne i skonsolidowane przechowywanie i transport między miejscami.

4. Gdy zbieranie pól jest zakończone

1. Upewnij się, że wszystkie probówki do mikrowirówek zawierające próbki znajdują się w 64-dołkowym pojemniku do przechowywania mikrowirówek w chłodziarce z lodem do transportu.
2. Umieść wszystkie zapasy do zbierania w terenie z powrotem w pudełku na sprzęt do zbierania.
3. Przetransportuj wszystkie próbki z powrotem do biura lub laboratorium i dokładnie sprawdź dwukrotnie każdą probówkę mikrowirówkową, aby upewnić się, że cały materiał próbki jest całkowicie zanurzony w buforze do lizy.
4. Umieść 64-dołkowy pojemnik do przechowywania mikrowirówek z próbkami w zamrażarce do czasu wysyłki lub przetworzenia.
   UWAGA: Przeciętna komercyjna zamrażarka o temperaturze -18 °C jest dopuszczalna do krótkotrwałego przechowywania.
5. Dokładnie oceń wszystkie materiały eksploatacyjne w skrzynce z narzędziami do zbierania i wymień je w razie potrzeby.
   UWAGA: Jest to szczególnie ważne, jeśli zaplanowanych jest wiele zdarzeń zbierania danych w terenie.
6. Przechowuj pojemnik na sprzęt do zbiórki w bezpiecznym miejscu do następnego wydarzenia zbiórki w terenie.
7. Pobierz wszystkie obrazy cyfrowe i upewnij się, że ich kopia zapasowa jest bezpiecznie tworzona na serwerze lub w systemie pamięci masowej w chmurze.
8. Zeskanuj lub sfotografuj oryginalne, odporne na warunki atmosferyczne strony notatnika polowego lub arkusze danych terenowych zawierające dane do momentu, aż wszystkie informacje będzie można wprowadzić do arkusza kalkulacyjnego projektu lub bazy danych.

5. Przesyłanie próbek i danych

1. Wyjmij z zamrażarki wszystkie 64-dołkowe pojemniki do przechowywania mikrowirówek z próbkami.
2. Ostrożnie zapakuj 64-dołkowe pudełka do przechowywania mikrowirówek z próbkami i notatnikiem terenowym lub arkuszami danych terenowych w standardowe pudełko wysyłkowe, dołącz dostarczoną etykietę wysyłkową z oryginalnym numerem konta nadawcy i wyślij gwarantowaną przez przewoźnika ekspresowego, z dnia na dzień, następnego dnia do dyrektora projektu.
3. Wyślij e-mailem numer śledzenia paczki i kopię zeskanowanych stron zeszytu lub arkuszy danych terenowych do dyrektora projektu.

6. Ekstrakcja DNA

1. Po otrzymaniu 64-dołkowych pojemników do przechowywania mikrowirówek należy je przechowywać w temperaturze -20 °C w celu zachowania DNA w próbkach do czasu, gdy będą one gotowe do ekstrakcji DNA.
2. W laboratorium ekstrahować DNA poprzez mielenie tkanki owadów przechowywanej w buforze do lizy po rozmrożeniu w temperaturze -20 °C. Dodać 20 μl proteinazy K i pozostawić próbkę na noc w temperaturze 56 °C w ogrzewanym inkubatorze nie dłużej niż 24 godziny.
3. Dodaj odpowiednie do czyszczenia i mycia, zgodnie z zaleceniami producenta¹³.
4. Przenieść próbkę zawieszoną w buforze do kolumny wirowej dołączonej do fiolki zbiorczej o pojemności 2 ml.
5. Wirować z prędkością 6 021 × g przez 60 s za pomocą wirówki. Dodaj odpowiednie do mycia i odpowiednio odwiruj.
6. Uwolnić związane DNA za pomocą buforu elucyjnego (30 μl) i odwirować próbkę do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Przejdź do sekwencjonowania, jeśli stężenie DNA przekracza 0,010 ng/ml. Zobacz Rysunek 5 dla stężenia DNA według typu tkanki.

7. Analiza danych sekwencji DNA

1. Przycinanie lub edytowanie wywołań podstawowych o niskiej jakości w sekwencjach wynikowych.
2. Wysyłanie zapytań do publicznych baz danych w celu potwierdzenia identyfikacji gatunków.
3. Dopasuj sekwencje do siebie, aby porównać różnice między osobami.

Results

Materiały do zebrania do 563 próbek zostały wysłane do ośmiu naukowców zajmujących się ochroną przyrody i społecznością z dziewięciu stanów w całym zakresie gatunków we wschodniej Ameryce Północnej. Materiały zostały wysłane w ciągu trzech miesięcy w 2021 r. przed lokalnymi godzinami szczytu lotów. Do tej pory otrzymaliśmy łącznie 160 próbek tkanek C. irus, które zostały pobrane (tab. 1). Genomowe DNA zostało wyekstrahowane zgodnie z protokołem dla tego typu próbki szczegółowo opisanym przez Storer et al.¹⁴. Spośród tych 160 próbek, DNA udało się wyekstrahować z 88 o średnim stężeniu 1,67 ng/μL (SE ± 2,98), a najwyższa wydajność DNA wyniosła 26,8 ng/μL. Stężenia określono ilościowo przy użyciu zestawu do oznaczania wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta z 2 μl ekstraktu.

Chociaż całkowita liczba otrzymanych próbek jest znacznie niższa niż ogólna liczba materiałów wykorzystanych do zbiórki, jest to głównie artefakt polegający na dostarczaniu nadmiaru materiałów do zbierania głównemu zbieraczowi lub liderowi zespołu, aby umożliwić im maksymalną elastyczność w zakresie włączania wielu miejsc zbiórki i/lub naukowców społeczności, jeśli jest to pożądane. Co więcej, C. iris jest rzadkim i zanikającym taksonem reprezentowanym przez ograniczone i często stosunkowo małe populacje w całym swoim istniejącym zasięgu. Pomimo tego ograniczenia, całkowita liczba otrzymanych próbek tkanek jest znaczna, zwłaszcza w porównaniu z tym, czego można by się spodziewać przy bardziej tradycyjnym pobieraniu próbek od pojedynczych dorosłych motyli.

Rysunek 1: Pojedyncze jednostki wszystkich niezbędnych materiałów oczekujące na wysyłkę do naukowców społeczności lub innego personelu odpowiedzialnego za zbieranie danych w terenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Indywidualna jednostka mobilna zawierająca wszystkie zapasy, przezroczyste plastikowe pudełko na sprzęt do zbierania i wypełnioną etykietę przewoźnika ekspresowego oczekującą na wysyłkę do naukowców społeczności lub innego personelu odpowiedzialnego za odbiór w terenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zdjęcie wyklutego jaja oszronionego motyla elfa (Callophrys irus) na dzikim łubinie (Lupinus perennis) z wyraźną w środku, z której wyłoniła się larwa noworodka. Należy pamiętać, że ogólny kolor wyklutego jaja jest biały. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zdjęcie niewyklutych, wyklutych jaj oszronionego motyla elfa (Callophrys irus) na dzikim łubinie (Lupinus perennis). Zwróć uwagę, że niewyklute jaja nie mają zauważalnego centralnego otworu, a ich ogólny kolor jest niebieskawo-zielony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Koncentracja DNA według typu tkanki. Linie środkowe pola reprezentują medianę, każde pole wydłuża IQR, a wąsy pola wynoszą 1,5 × IQR, przy czym wszelkie punkty poza nimi są wartościami odstającymi. Próbki zawierające pojedynczą skrzynkę na jaja miały tylko jedną skrzynkę na jaja, a próbki zawierające wiele skrzynek na jaja miały co najmniej dwie skrzynki, przy czym liczba przypadków wahała się od 2 do 20 (średnia = 5,3) na próbkę. Skrót: IQR = rozstęp międzykwartylowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział szt.

stan	Skrzynka na jajka	Skrzynki na jajka	Frass powiedział:	noga	linieć	Suma końcowa
Arkansas				cyfra arabska		cyfra arabska
Floryda	3	10		7	22 Rozdział 22	42 Rozdział 42
Michigan
New Hampshire	24	6		15		Rozdział 45
Nowy Jork				Rozdział 30		Rozdział 30
Ohio
Wisconsin	9	5		5		Rozdział 19
Oklahoma			16	6		22 Rozdział 22
Suma końcowa	36	21	16	65	22 Rozdział 22	160

Tabela 1: Liczba i rodzaj materiału tkankowego pobranego według stanu.

Rysunek uzupełniający S1: Pierwsza strona dwustronnego, laminowanego, skondensowanego i ilustrowanego protokołu do użytku w terenie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2. Ostatnia strona dwustronnego, laminowanego, skondensowanego, ilustrowanego protokołu do użytku w terenie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Protokół ten opisuje metodę terenową służącą do nieniszczącego pobierania próbek rzadkich motyli pod kątem struktury genetycznej populacji lub analiz kodów kreskowych DNA. Ogólne korzyści płynące z tego protokołu zostały specjalnie zaprojektowane, aby pomóc zmaksymalizować szerokie wdrożenie przez osoby o różnym doświadczeniu i poziomie umiejętności, takie jak naukowcy społeczni, praktycy ochrony przyrody i studenci. Należą do nich stosunkowo niski koszt całkowity, łatwe do zdobycia materiały eksploatacyjne i sprzęt, prosta i przystępna metoda bez wielu nadmiernie skomplikowanych kroków oraz łatwe wdrożenie na dużym obszarze geograficznym. Dodatkowo celuje w resztkowy materiał organiczny, co eliminuje potrzebę tymczasowego chwytania lub manipulowania, a przy okazji potencjalnie szkodzi organizmom żywym w celu pozyskania próbek genetycznych. Co więcej, wydłuża potencjalny okres dostępny do pobrania próbek poza tradycyjną fenologię lub długość życia na danym etapie życia, zwiększając elastyczność i ogólne możliwości pobierania, aby pomóc zmaksymalizować liczbę próbek.

Podczas gdy głównym taksonem dla tych wysiłków był oszroniony motyl elf, szeroko rozpowszechniony, ale malejący specjalista od siedlisk, protokół ten może być stosowany szerzej do wielu innych owadów, w tym tych budzących obawy o ochronę. Podobnie, chociaż protokół jest ukierunkowany na zbieranie wyklutych jaj jako źródła materiału genetycznego, można go łatwo zaadaptować do innych, potencjalnie bardziej tradycyjnych próbek (np. nóg, fragmentów skrzydeł, klipsów antenowych), a nawet całych organizmów. Jednak ten aspekt jest również potencjalnym ograniczeniem protokołu. Chociaż zdecydowana większość etapów została zaprojektowana tak, aby była stosunkowo prosta i szybka do wykonania, kompleksowe wyszukiwanie płatów larw roślin żywicielskich pod kątem jaj wylęgowych, które pojedynczo mają zwykle <1,0 mm średnicy, jest czasochłonne i pracochłonne. Niemniej jednak tak szeroko zakrojona działalność w zakresie pobierania próbek jest szczególnie idealna dla większej sieci uczestników, takich jak naukowcy społeczni.

Podobnie jak w przypadku innych projektów terenowych, niezbędne jest staranne przygotowanie. Obejmuje to przeprowadzenie pełnej inwentaryzacji materiałów potrzebnych do upewnienia się, że nie brakuje żadnych przedmiotów, że wszelkie wymagane prace przygotowawcze zostały zakończone oraz że są one dobrze zorganizowane, bezpiecznie zapakowane i gotowe do użycia w terenie. Ponadto wszyscy pracownicy terenowi, w szczególności ci, którzy przeprowadzają pobieranie tkanek, powinni szczegółowo zapoznać się z protokołem pobrania przed jakimkolwiek wydarzeniem związanym z pobraniem i kierować wszelkie pytania do osób nadzorujących projekt. Po dotarciu w teren część protokołu dotycząca pobierania próbek wymaga skrupulatnej dbałości o szczegóły. Obejmuje to zlokalizowanie i dokładne sprawdzenie wszelkich komórek jajowych, aby upewnić się, że są wylęgnięte, a tym samym nadają się do pobrania, dokładne czyszczenie kleszczy, wymianę rękawiczek w celu zmniejszenia przenoszenia tkanek między zdarzeniami pobierania próbek oraz upewnienie się, że próbki tkanek są całkowicie zanurzone w buforze do lizy w każdej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wreszcie, niezbędne jest rejestrowanie dokładnych i szczegółowych danych, które obejmują powiązanie unikalnej etykiety identyfikacyjnej przypisanej z probówki mikrowirówki z konkretną pobraną próbką i wszystkimi innymi istotnymi informacjami o pobraniu. Chociaż ten krok jest rutynowy w badaniach naukowych, często musi być dokładnie wyjaśniony i wzmocniony dla społeczności naukowej.

W tym miejscu pokazujemy potencjał wykorzystania naukowców społecznych do nieśmiercionośnego pobierania próbek od małych, rzadkich i zagrożonych gatunków. Istnieją jednak pewne potencjalne ograniczenia, o których należy pamiętać podczas analizowania wszelkich uzyskanych danych genetycznych. Na przykład, podczas gdy łączenie próbek z jednego plastra zwiększa szanse na odzyskanie wystarczającej ilości DNA do wykrycia, potencjalnie wprowadza również heterozygotyczność. Ponadto, ponieważ protokół obejmuje pobranie kosmówki z wyklutych komórek jajowych, w populacji można pobrać próbki tylko od samic motyli, reprezentujących rodzicielskie DNA. Niemniej jednak, ponieważ żadne wcześniejsze dane genetyczne na poziomie populacji nie były dostępne dla C. irus, uzyskane w ten sposób informacje mogą przynieść korzyści jedynie w zakresie ochrony gatunków i zarządzania nimi. Na przykład, podczas gdy dokładny, szczegółowy projekt badania i staranny dobór markerów byłyby wymagane do odpowiedniej oceny struktury populacji, przedstawiony tutaj protokół pobierania próbek oraz zastosowanie kodu kreskowego DNA podjednostki 1 oksydazy cytochromowej c (CO1) mogą być wykorzystane do wykrycia występowania rzadkich lub zagrożonych taksonów. Dodatkowe omówienie użyteczności i zastosowania sekwencjonowania DNA z nieśmiercionośnego próbkowania opisanego tutaj jest szczegółowo opisane przez Storer et. ^al.14.

Poza głównym celem, jakim jest zbieranie próbek do analizy genetycznej, protokół podkreśla również, że uczestnicy wykonują szczegółowe zdjęcia cyfrowe wszystkich miejsc polowych, miejsc pobrań, obecnych larw roślin żywicielskich i wszelkich innych elementów otaczającego siedliska, które mogą być istotne. Taka dokumentacja pomaga zapewnić ogólną ocenę siedliska, która jest przydatna do zilustrowania istniejących warunków terenowych, takich jak fenologia roślin, gęstość zasobów żywicielskich i historia zarządzania (np. niedawny przepisany pożar). Takie informacje są szczególnie przydatne w przypadku projektów, w których próbki terenowe są pobierane w szerszym okresie czasowym, aby umożliwić bardziej szczegółowe porównania środowiskowe.

Wreszcie, w związku z tym, że globalny spadek liczebności owadów nadal przyspiesza, niezwykle potrzebne są rozszerzone działania w zakresie oceny i monitorowania gatunków^15,16. Wykorzystanie szerszego zaangażowania partycypacyjnego ze strony naukowców społecznych, studentów (np. stażystów i stypendystów U.S. Fish and Wildlife Service) oraz praktyków ochrony przyrody oferuje coraz bardziej realne możliwości obszernego gromadzenia danych wielu typów, w tym próbek DNA. W związku z tym dane generowane przez ten protokół mają wiele możliwych zastosowań. Obejmują one pomoc w informowaniu o działaniach ochronnych (np. planowaniu, odbudowie i zarządzaniu), decyzje dotyczące wpisu na listę lub oceny stanu gatunków oraz badania ekologiczne, populacyjne i taksonomiczne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-litrowa chłodnica Igloo Playmate Przenośna	Amazon	NA	Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 chłodnica
250 kolumn DNeasy Mini Spin, proteinaza K,, probówki zbiorcze (2 ml)	Qiagen	69506	Qiagen DNeasy Blood & Zestaw chusteczek Ilość na rozkładaną jednostkę: NA
Andwin Scientific Supplier Diversity Partner MARKERY LABORATORYJNE CZARNE	FisherSci	NC9280166	odporny na etanol Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 znaczniki
Pudełko wysyłkowe			Ilość na rozkładaną jednostkę: w razie potrzeby
Butelki do mycia z polietylenu Eisco, LDPE	FisherSci	S14091	butelka ze sprayem lub spryskiwaczem klasy lab (na etanol lub alkohol) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 butelka
FedEx U.S. express airbill	wysyłki FedEx		NA Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 etykiety
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 1,5 ml	FisherSci		NC9386261 1,5 ml Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: 128 tubek
Kleszcze, #4a, bardzo cienkie, ale bardzo mocne końcówki (33 mm), o długości 4-3/8" (111 mm) Kleszcze	Bioquip	4523	Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 proste kleszcze
Kleszcze, #7, zakrzywione końcówki (13 mm), bardzo drobne punkty, 4-1/2" (114 mm) długości	Bioquip	4527	Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 kleszcze zakrzywione
Kimberly-Clark Professional  Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-warstwowe	chusteczki FisherSci	06-666A	kimwipes (lub inne sterylne chusteczki nawilżane) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 pudełko
Laminowany Ilustrowany protokół zbierania w terenie	Skrócony protokół NA	NA	Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 protokół
Laminowana lista materiałów	NA	NA	Lista dostaw NA Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 lista
Lily Sugar 'N Cream Oryginalna solidna przędza, 2.5 uncji, średnia grubość 4, 100% bawełna - gorący róż - Pranie w pralce i Sucha			różowa przędza Amazon NA (do zabezpieczenia kleszczy w celu zapewnienia widoczności) Ilość na rozmieszczaną jednostkę: 2 jardy
Lupa firmy Bausch & Lomb, 10x lupa Coddington Soczewka	Amazon	NA	Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 soczewki ręczne
MyGift Przezroczyste plastikowe 2-poziomowe tace Pudełko do przechowywania artykułów rzemieślniczych / futerał pierwszej pomocy z górnym uchwytem i Zamek zatrzaskowy	Pudełko do przechowywania dostaw Amazon NA Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: 1 pudełko
Nitryl, Rękawiczki jednorazowe, L, Bezpudrowe, Grubość dłoni 2,8 mil Nitrylowe	Grainger	60NU14	(duże) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 pudełko
Nitryl, Rękawiczki jednorazowe, M, bezpudrowe, 2,8 mil Grubość dłoni	Grainger	60NU13	Rękawice laboratoryjne nitrylowe (średnie) Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 pudełko
Qiagen, Inc.  BUFFER ATL (200 ML)	Qiagen	19076	Qiagen ATL bufor do lizy Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: 180 &mikro; l/rura; 128 tubek
Rite In The Rain Odporny na warunki atmosferyczne boczny spiralny notebook, żółta okładka, uniwersalny wzór strony (nr 373-MX), 11 x 8,75 x 0,5		NA	odporny na warunki atmosferyczne notebook polowy Ilość na rozkładaną jednostkę: 1 notebook
Showgard Professional Stamp Szczypce 6" 904 z okrągłą końcówką Pęseta	Amazon	NA	6" szczypce do końcówek łopatowych Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 długie kleszcze łopatkowe
Texwipe PolySat Wstępnie zwilżone wycieraczki	FisherSci	18-366-231	chusteczki nasączone alkoholem Ilość na rozkładaną jednostkę: 100 chusteczek
Thermo Scientific CryoBoxes	FisherSci	12-565-227	64-dołkowe probówki do mikrowirówek do zbierania/przechowywania Ilość na rozkładaną jednostkę: 2 pudełka
			Materiał opakowaniowy Ilość na jednostkę, którą można rozmieścić: w razie potrzeby