W badaniu wykorzystano gatunki Lactobacillaceae jako model w celu wykazania skuteczności obrazowej analizy cytometrii przepływowej w badaniu autoagregacji drobnoustrojów. Nacisk położono na analizę reakcji autoagregacji gatunków Lactobacillaceae na węglowodany proste z diety. Najczęściej stosowanymi metodami pomiaru autoagregacji są spektrofotometria, która mierzy zawiesinę drobnoustrojów, zmętnienie lub gęstość optyczną, oraz tradycyjne techniki mikroskopowe, takie jak jasne pole, kontrast fazowy i mikroskopia fluorescencyjna.
Mówiąc o obrazowaniu o wysokiej przepustowości, jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych jest segmentacja pojedynczych zdarzeń. W tym protokole jest to pojedynczy agregat. Obrazowa cytometria przepływowa elegancko radzi sobie z tym wyzwaniem i daje naukowcom potężne narzędzie do badania autoagregacji.
Zacznij od zaszczepienia pięciu mililitrów bulionu Lactobacilli MRS pojedynczą kolonią szczepu Lactobacillaceae. Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach statycznych przez noc. Rozcieńczyć kulturę komórkową w stosunku 1 do 100 w trzech mililitrach 50% wzbogaconego bulionu sojowego tryptycznego.
Wiruj kulturę i inkubuj ją. Następnie odwróć probówkę, aby wymieszać komórki w pożywce przed przeniesieniem od 200 do 300 mikrolitrów próbki do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby rozpocząć analizę cytometrii przepływowej, najpierw ustaw laser 785-nanometrowy na moc pięciu miliwatów do pomiarów ciemnego pola.
Użyj obiektywu 60X z przysłoną numeryczną 0,9, a następnie wybierz ustawienie wysokiej czułości i ustaw szybkość na niską. Aby zapewnić stabilność koralika kalibracyjnego, naciśnij przycisk odtwarzania w pudełku fluidics i sprawdź obrazy koralików, które powinny być ostre i wyraźne. Wygeneruj nowy wykres rozrzutu w polu obszaru roboczego, wybierając pozycję Nowy wykres rozrzutu.
Następnie wybierz obszar w kanale jasnego pola, który odpowiada intensywności kanału SSC, i wyklucz kulki kalibracyjne, które biegną równolegle w próbce. Następnie naciśnij przycisk Load i umieść probówkę zawierającą próbkę Lactobacillaceae w uchwycie. W polu ustawień pozyskiwania wprowadź nazwę próbki i określ lokalizację przechowywania danych.
Ustaw liczbę zdarzeń do zebrania, zwykle w zakresie od 10 000 do 20 000 zdarzeń. Teraz rozpocznij proces nabywania, klikając przycisk Rekord znajdujący się w polu przejęcia. Proces zostanie zatrzymany po osiągnięciu określonej liczby zdarzeń.
Naciśnij przycisk Return, aby rozładować rurkę i wyjmij ją z uchwytu zgodnie z monitem w wyskakującym okienku. Po powtórzeniu procesu dla wszystkich próbek zapisz szablon, aby zachować jednolitość pozyskiwania danych. W celu analizy danych, aby załadować surowy plik do oprogramowania do analizy, kliknij Plik i otwórz plik rif.
W otwartym oknie wybierz Użyj analizy akwizycji, a następnie kliknij OK. Następnie, aby utworzyć histogram średniej kwadratowej pierwiastka gradientu, kliknij przycisk Nowy histogram i wybierz populację z akwizycji do analizy. W obszarze Funkcja osi X wybierz opcję Gradient RMS kanału jasnego pola. Następnie umieść bramkę, aby wykluczyć zdarzenia nieaktywne, klikając przycisk Utwórz obszar linii w obszarze analizy.
Utwórz wykres rozrzutu obszaru w funkcji współczynnika proporcji, klikając przycisk Nowy wykres rozrzutu w obszarze analizy. Wybierz skupioną populację w oknie Nowy wykres rozrzutu, a następnie wybierz obszar kanału jasnego pola dla elementu osi X. Wybierz współczynnik proporcji dla funkcji osi Y.
Narysuj bramkę na wykresie rozrzutu za pomocą przycisku Utwórz prostokąt na podstawie wartości obszaru dla zagregowanej populacji zdarzeń. Podobnie, narysuj kolejną bramę dla populacji singli i małych agregatów. Zapisz analizę danych jako szablon, klikając kartę Plik i wybierając opcję Zapisz jako szablon.
ast, a następnie otwórz następny przykładowy plik w tym samym szablonie, aby utworzyć plik analizy danych. Aby zmierzyć zagregowany rozkład wielkości, zacznij od wykreślenia histogramu obszaru populacji zdarzeń agregacji. Zapisz analizę danych, klikając zakładkę Plik i wybierając opcję Zapisz jako szablon.
Po zapisaniu otwórz następny przykładowy plik w tym samym szablonie dla pliku analizy danych. Pojedyncze komórki, małe agregaty, duże agregaty i łańcuchy obserwowano u LGG i L. paracasei. Nie można było jednak odróżnić łańcuchów od większych agregatów.
Zaobserwowano znaczące różnice w charakterystyce agregacji różnych szczepów LAB w odpowiedzi na cukry fermentujące lub niefermentujące.
