Este trabalho foi apoiado pela Israeli Science Foundation (Grant 119/16) e IMoh grant (3-15656) para o IKG. R.S. apoiado pela bolsa Kreitman.

O arquivo .ast, com o modelo para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como exemplo, é fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1.
1. Preparação de mídia
<ol><li>Prepare o caldo Lactobacilli MRS seguindo as instruções do fabricante (55 g em 1 L de água deionizada) e placas de ágar Lactobacilli MRS com ágar 1,5% (p/v) (ver Tabela de Materiais). Após a esterilização em autoclave, o meio está pronto para uso direto ou pode ser armazenado a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 50% (15 g em 1 L de água deionizada) de caldo de soja tríptico (TSB) (ver Tabela de Materiais), TSB suplementado com 1% (p / v) de D- (+) -glicose e 1% (p / v) de D- (+) -rafinose e, em seguida, autoclave para esterilizar o meio. É preferível armazená-lo a 4 °C para evitar contaminação.</li>
	<li>Para um meio tamponado com glicose, prepare TSB suplementado com D-(+)-glicose a 1% (p / v), 5 mM de fosfato de potássio monobásico junto com potássio dibásico e 100 mM MOPS (ácido propano sulfônico 3-(N-morfolino), consulte a Tabela de Materiais) pH 7. Em seguida, autoclave para esterilizar o meio.</li>
</ol>2. Preparação das amostras
NOTA: Esta etapa envolve a avaliação da agregação celular em resposta ao açúcar fermentável ou não fermentável de nossa dieta. Uma representação esquemática do processo de preparação da amostra é representada na Figura 1.
<ol><li>Retire a cepa de Lactobacillaceae de um estoque de glicerol congelado (50% de glicerol) em um prato de caldo Lactobacilli MRS (1,5% de ágar). NOTA: No experimento de exemplo apresentado aqui, foram utilizadas cepas probióticas de Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) e Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). Para expandir essa metodologia para membros probióticos adicionais do filo firmicutes, foi selecionado Bacillus coagulans (ATCC 10545).</li>
	<li>Cultive as células durante a noite a 37 °C em condições estáticas.</li>
	<li>Inocular 5 ml de caldo de Lactobacilos MRS com uma única colónia e cultivá-lo a 37 °C em condições estáticas durante a noite.</li>
	<li>Dilua a cultura de células da etapa anterior (1:100) em 3 mL de caldo de soja tríptico (TSB) a 50%, TSB suplementado com D-(+)-glicose a 1% (p/v) ou TSB suplementado com D-(+)-rafinose a 1% (p/v).</li>
	<li>Incubar durante a noite a 37 °C em condições estáticas.</li>
	<li>Prepare a amostra misturando as células uniformemente no meio e vortex suavemente o tubo de cultura de células da etapa 2.5. Inverta suavemente o tubo de ensaio até que a mistura completa ocorra. Transfira 200-300 μL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. NOTA: É essencial não sonicar a amostra para evitar a quebra dos agregados. Durante a aquisição de dados das etapas 3.4 a 3.10, pode haver casos em que as amostras estejam muito concentradas. Se se verificar que a amostra está a correr muito lentamente ou que não está a correr, pode-se diluir a amostra com o meio fresco adequado.</li>
</ol>3. Aquisição de dados
<ol><li>Configure o citômetro de fluxo de imagem de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Defina o laser de 785 nm para 5 mW para medição de campo escuro (equivalente ao espalhamento lateral na citometria de fluxo convencional, abreviado como SSC). Use uma lente de 60x com uma abertura numérica (NA) de 0,9, selecione alta sensibilidade e defina a velocidade para baixa.</li>
	<li>Antes de coletar qualquer dado, certifique-se da estabilidade do fluxo dos grânulos de calibração no canal SSC. Clique no botão play na caixa "fluidics" e examine a qualidade das imagens das contas. As imagens das contas devem parecer nítidas e nítidas.</li>
	<li>Pressione o botão Carregar e coloque um tubo com uma amostra (da etapa 2.6) no suporte.</li>
	<li>Crie um novo gráfico de dispersão na caixa "área de trabalho". Clique em Novo gráfico de dispersão e selecione a área no canal de campo claro correspondente à intensidade do canal SSC. Exclua os grânulos de calibração que são executados no instrumento junto com a amostra. NOTA: Os grânulos podem ser excluídos carregando uma amostra apenas com tampão e identificando os grânulos na área vs. Gráfico SSC. Em seguida, desenhe um portão ao redor da população de contas usando o botão Criar região de polígono .</li>
	<li>Na caixa "Configurações de aquisição", insira o nome da amostra, especifique o local para o armazenamento de dados, escolha a população (todas as células sem contas) para registrar e defina o número de eventos a serem coletados. Normalmente, 10.000 a 20.000 eventos são suficientes.</li>
	<li>Clique no botão Gravar localizado na caixa "Aquisição" e o processo de aquisição terminará automaticamente assim que o número especificado de eventos for atingido.</li>
	<li>Clique no botão Retornar para descarregar o tubo e remova o tubo do suporte quando solicitado em uma pequena janela.</li>
	<li>Repita as etapas 3.5 a 3.9 para cada amostra.</li>
	<li>Salve o modelo para manter a uniformidade da aquisição de dados para repetições subsequentes.</li>
</ol>4. Análise dos dados
<ol><li>Meça a porcentagem (%) de autoagregação da população.<ol><li>Analise os dados adquiridos no citômetro de fluxo de imagem usando o software IDEAS (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Crie um arquivo de análise de dados (.daf) a partir do arquivo bruto (.rif) carregando o arquivo (.rif) no software de análise. Clique no botão Arquivo e abra o arquivo (.rif) necessário. Na janela aberta, clique em usar análise de aquisição e, em seguida, clique em OK.</li>
		<li>Crie um histograma de gradiente RMS (uma medida de contraste e foco da imagem) no canal de campo claro para identificar eventos focados. Na área de análise, clique no botão Novo histograma . Na janela "Novo histograma", escolha a população da aquisição a ser analisada e, na "feição do eixo x", selecione Gradiente RMS do canal de campo claro.<ol><li>Coloque uma porta clicando no botão Criar região de linha na área de análise para excluir eventos não focados (Figura 2A). NOTA: Normalmente, a região da linha "Focada" deve incluir 80% a 90% dos eventos com a pontuação RMS de gradiente mais alta, mas limites específicos para células "em foco" devem ser determinados para cada configuração experimental.</li>
		</ol></li>
		<li>Crie um gráfico de dispersão da área (μm2) em relação à proporção (largura dividida pelo comprimento de uma elipse de melhor ajuste) do canal de campo claro. Pressione o botão Novo gráfico de dispersão na área de análise. Na janela "Novo gráfico de dispersão", escolha a população focada na etapa 4.1.3.<ol><li>Selecione Área do canal de campo claro para o recurso do eixo x e Taxa de proporção do canal de campo claro para o recurso do eixo y. Este gráfico de dispersão permite que a população focada distinga singlets e pequenos eventos agregados de agregados e cadeias microbianas maiores.</li>
		</ol></li>
		<li>Neste gráfico de dispersão, desenhe uma porta usando o botão Criar Região de Retângulo (ou Criar Região de Polígono) com base no valor da área para a população de eventos de agregação e outra porta para a população de singlets e pequenas agregações (Figura 2B). NOTA: Em certos contextos, separar pequenos agregados de singlets pode ser um desafio, para que possam ser combinados no mesmo portão. O mesmo se aplica a agregados e cadeias maiores (Figura 3).</li>
		<li>Revise e avalie manualmente as imagens de eventos dentro de cada portão para verificar a confiabilidade da estratégia de gating. Se necessário, ajuste o valor da área para o portão. Faça isso selecionando a população revisada no menu suspenso "Populações". NOTA: O gating não tem valor de área específico, pois pode variar dependendo das características das bactérias que estão sendo analisadas.</li>
		<li>Salve a análise de dados como um modelo. Clique na guia Arquivo , selecione Salvar como Template.ast e abra o próximo arquivo de amostra (.rif) no mesmo modelo para criar o arquivo de análise de dados (.daf) (Compatível com o arquivo .ast como exemplo para LGG).</li>
		<li>Crie uma tabela de estatísticas para enumerar os principais eventos para análise posterior. Clique na guia Relatórios e, em seguida, clique em Definir relatório de estatísticas.</li>
		<li>Na nova janela, clique em Adicionar Colunas. Adicione a contagem de singlets/agregados e as estatísticas de %gated. Em "estatísticas", escolha %gated/count e, na população selecionada, escolha singlets/agregados. Clique em Adicionar estatísticas para adicionar a estatística à lista e salvá-la como um modelo.</li>
		<li>Clique em Gerar relatório estatístico e escolha o modelo estatístico e os arquivos (.daf) para análise.</li>
	</ol></li>
	<li>Meça a distribuição de tamanho dos agregados.<ol><li>Para analisar o tamanho médio dos eventos de agregação, plote um histograma da área (μm2) da população de eventos de agregação da etapa 4.1.5 (Figura 2C).</li>
		<li>Salve a análise de dados como um modelo. Clique na guia Arquivo , selecione Salvar como Modelo e abra o próximo arquivo de exemplo (.rif) no mesmo modelo para o arquivo de análise de dados (.daf).</li>
		<li>Repita as etapas 4.1.7 a 4.19. Para o tamanho das agregações, escolha média em estatísticas e selecione agregações na população selecionada. Em recursos, selecione Área do canal de campo claro. Clique em Adicionar estatísticas para adicionar a estatística à lista e salvá-la como um modelo.</li>
		<li>Repita a etapa 4.1.9 para gerar um relatório estatístico.</li>
	</ol></li>
</ol>

Análise quantitativa da autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem

<ol>
	<li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+autoaggregation.">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li><li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtaA,+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces.">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein,+Flp,+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae.">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li><li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells.">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars.">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).</li><li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota.">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268 (2021).</li><li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92.">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li><li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+&amp;#34;Dried+Ossban&amp;#34;.">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &amp;#34;Dried Ossban&amp;#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).</li><li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus&lt;/em&gt;+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production.">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus&lt;/em&gt; GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy.">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li><li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni.">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li><li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli:+cell+aggregation+and+biofilm+formation.">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry.">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87 (2022).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry.">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).</li><li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host:+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective.">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li><li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis.">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li><li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production.">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).</li><li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms:+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members.">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li><li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates.">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096 (2021).</li><li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics.">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).</li></ol>

A citometria de fluxo é um método amplamente utilizado para quantificar intensidades de fluorescência em células eucarióticas, mas pode não fornecer medições precisas para células bacterianas devido ao seu tamanho maior ou agregados pequenos. Esses fatores podem impactar significativamente a quantificação precisa da autoagregação e o nível basal de formação de agregados em diferentes condições. Para resolver isso, a citometria de fluxo de imagem (IFC) foi empregada para obter uma melhor resolução de c...

A autoagregação bacteriana é considerada uma etapa primária na formação do biofilme. Nesse processo (às vezes também chamado de autoaglutinação ou floculação), bactérias do mesmo tipo formam aglomerados multicelulares que eventualmente se depositam no fundo dos tubos de cultura ou se ligam ao tecido ou superfície alvo1.
A autoagregação é um fenômeno amplamente observado e foi demonstrado até agora em patógenos Gram-negativos, como o patógeno oportunista Acinetobacter baumannii2, o patógeno dentário Aggregobacter actinomycetemcomitans3 e o patógeno emergente Burkholderia pseudomallei4. A autoagregação também foi descrita em várias cepas Gram-positivas probióticas 5,6,7,8. Em Lactobacillus (L.) acidophilus, a autoagregação foi parcialmente mediada por proteínas da camada S e correlacionada com uma adesão à xilana7. Da mesma forma, encontramos uma correlação entre a autoagregação dependente de glicose e a indução das propriedades adesivas (julgadas pela adesão à mucina) das espécies probióticas Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei e Lactiplantibacillus plantarum5. O aumento da autoagregação provavelmente refletiu mudanças na expressão de adesinas celulares em resposta à glicose e seus catabólitos9. Embora os mecanismos moleculares de autoagregação ainda não tenham sido determinados, foi demonstrado que esse processo altera o fenótipo das bactérias agregadas e lhes concede maior tolerância a estressores ambientais1, bem como maior sensibilidade a moléculas sensíveis a quorum10.
Várias abordagens têm sido usadas para medir a autoagregação; Uma abordagem experimental é deixar as culturas repousarem estaticamente em tubos de cultura estreitos por um determinado tempo. As culturas de controle permanecem turvas, enquanto as culturas de autoagregação se depositam no fundo do tubo. Uma abordagem mais quantitativa mede a autoagregação por ensaio de sedimentação ou sedimentação11.
A citometria de fluxo também tem sido cada vez mais empregada nos últimos anos para investigar a autoagregação bacteriana. Este método é apropriado para analisar partículas entre aproximadamente 0,5 e 1000 μm de tamanho. A bactéria única ou agregados formados são suspensos em fluido, alimentados em um fluxo e podem ser detectados um a um11. O registro da luz espalhada para frente permite medir o tamanho relativo da célula ou agregado. É relativamente rápido e direto, mas não pode detectar vários parâmetros, como o tamanho do agregado ou o número médio de células em agregados. Portanto, essa abordagem pode ser complementada microscopicamente, permitindo que mais parâmetros sejam verificados12. No entanto, a microscopia tradicional é demorada e, portanto, limita o número de amostras testadas e o poder estatístico da análise. Em geral, a citometria de fluxo de imagem fornece vários recursos em comparação com a citometria de fluxo tradicional, como análise simultânea da morfologia celular e fenótipo, realização de análise baseada em imagem, detecção de eventos raros e validação de dados de citometria de fluxo13. Essas vantagens aumentam as capacidades da citometria de fluxo e facilitam um exame mais detalhado das populações de células.
Este estudo fornece um protocolo valioso para citometria de fluxo de imagem para monitorar a autoagregação em bactérias do ácido lático (BAL). Esses bastonetes Gram-positivos são anaeróbios facultativos e pertencem ao grupo LAB. Esses eficientes fermentadores de glicose geram ácido lático como seu principal produto final do metabolismo dos carboidratos14. Essas bactérias são membros benéficos do microbioma e são encontradas naturalmente no trato gastrointestinal (TGI) de humanos e animais, bem como no trato urogenital das mulheres15. Portanto, a caracterização exata de suas propriedades de autoagregação é de alto interesse biotecnológico e clínico.
Nossos achados anteriores indicaram que o nível basal de autoagregação difere entre diferentes cepas probióticas. Essa heterogeneidade é afetada pelos diferentes carboidratos utilizados como fonte de carbono5. Para superar essa propriedade fundamental das bactérias probióticas, os efeitos dos carboidratos da dieta foram monitorados na autoagregação no nível de célula única usando IFC. Essa abordagem baseada em IFC combina a potência e a velocidade dos citômetros de fluxo tradicionais com a resolução do microscópio. Portanto, permite medidas morfométricas complexas de alta taxa de forma fenotipicamente definida16,17. Essa abordagem pode ser estendida a outras bactérias probióticas e patogênicas, combinadas com repórteres fluorescentes para monitorar a expressão gênica e cepas marcadas com fluorescência para monitorar a presença e abundância de espécies bacterianas específicas em agregados heterogêneos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Typtic Soy Broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83400-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Lactobacilli MRS broth</td>
			<td>Baeton,Dickinson and Company</td>
			<td>288130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)</td>
			<td>FL medical</td>
			<td>23053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDEAS Software</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&#38;bd=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageStream X Mark II</td>
			<td>Amnis/EMD Millipore</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific, 174.18 g/mol</td>
			<td>BP363-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma, 136.09 g/mol</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging flow cytometry to study microbial autoaggregation

As bactérias benéficas e probióticas desempenham papéis essenciais em seus hospedeiros, proporcionando vários benefícios à saúde, incluindo imunidade a doenças infecciosas. A família Lactobacillaceae consiste em bactérias Gram-positivas com propriedades probióticas confirmadas. Este estudo utiliza espécies de Lactobacillaceae como modelo para demonstrar a eficácia da análise de alto rendimento de célula única no estudo da agregação celular. O foco está em analisar a resposta dessas espécies benéficas aos carboidratos simples da dieta.
O estudo mostra como a citometria de fluxo de imagem (IFC) pode superar as diferenças fundamentais na montagem de bactérias probióticas na presença e ausência de carboidratos. O IFC combina o poder e a velocidade da citometria de fluxo convencional com a resolução espacial da microscopia, permitindo medições morfométricas complexas de alta taxa de maneira fenotipicamente definida em uma biblioteca de cepas e condições bacterianas benéficas. Este protocolo fornece informações sobre a autoagregação de espécies de Lactobacillaceae e lança luz sobre sua resposta aos carboidratos da dieta, contribuindo para a compreensão dos mecanismos por trás dos efeitos benéficos dessas bactérias probióticas.

Bacterial autoaggregation is considered a primary step in biofilm formation. In this process (sometimes also called autoagglutination or flocculation), bacteria of the same type form multicellular clumps that eventually settle at the bottom of culture tubes or attach to their target tissue or surface1.
Autoaggregation is a widely observed phenomenon and has been shown so far in Gram-negative pathogens such as the opportunistic pathogen Acinetobacter baumannii2, the dental pathogen Aggregobacter actinomycetemcomitans3, and the emerging pathogen Burkholderia pseudomallei4. Autoaggregation has also been described in several probiotic Gram-positive strains5,6,7,8. In Lactobacillus (L.) acidophilus, autoaggregation was partially mediated by S-layer proteins and correlated with an adhesion to xylan7. Similarly, we found a correlation between glucose-dependent autoaggregation and induction of the adhesive properties (as judged by adhesion to mucin) of the probiotic species Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei, and Lactiplantibacillus plantarum5. The increased autoaggregation most likely reflected changes in the expression of cellular adhesins in response to glucose and its catabolites9. While the molecular mechanisms of autoaggregation remain to be determined, it has been shown that this process alters the phenotype of the aggregated bacteria and grants them enhanced tolerance to environmental stressors1, as well as increased sensitivity to quorum sensing molecules10.
Several approaches have been used to measure autoaggregation; one experimental approach is to let cultures stand statically in narrow culture tubes for a given time. Control cultures remain turbid, whereas autoaggregation cultures will settle at the bottom of the tube. A more quantitative approach measures autoaggregation by sedimentation or settling assay11.
Flow cytometry has also been increasingly employed in recent years to investigate bacterial autoaggregation. This method is appropriate for analyzing particles between approximately 0.5 and 1000 &#181;m in size. The single bacterium or formed aggregates are suspended in fluid, fed into a stream, and can be detected one by one11. Recording forward scattered light allows measuring the relative size of the cell or aggregate. It is relatively fast and straightforward but cannot detect several parameters, such as aggregate size or the average number of cells in aggregates. Therefore, this approach can be complemented microscopically, allowing more parameters to be checked12. However, traditional microscopy is time-consuming and thereby limits the number of tested samples and the statistical power of the analysis. In general, imaging flow cytometry provides several features compared to traditional flow cytometry, such as simultaneous analysis of cell morphology and phenotype, conducting image-based analysis, detecting rare events, and validating flow cytometry data13. These advantages enhance the capabilities of flow cytometry and facilitate a more detailed examination of cell populations.
This study provides a valuable protocol for imaging flow cytometry to monitor autoaggregation in lactic acid bacteria (LAB). These Gram-positive rods are facultative anaerobes and belong to the LAB group. These efficient glucose fermenters generate lactic acid as their main end-product of carbohydrate metabolism14. These bacteria are beneficial core members of the microbiome and are naturally found in the gastrointestinal tract (GIT) of humans and animals, as well as in the urogenital tract of females15. Therefore, the exact characterization of their autoaggregation properties is of high biotechnological and clinical interest.
Our previous findings indicated that the basal level of autoaggregation differs between different probiotic strains. This heterogeneity is affected by the different carbohydrates used as a carbon source5. To overcome this fundamental property of probiotic bacteria, the effects of carbohydrates from the diet were monitored on autoaggregation on the single-cell level using IFC. This IFC-based approach combines the power and speed of traditional flow cytometers with the microscope&#39;s resolution. Therefore, it allows high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined way16,17. This approach can be extended to other probiotic and pathogenic bacteria, combined with fluorescent reporters to monitor gene expression, and fluorescently labeled strains to monitor the presence and abundance of specific bacterial species in heterogeneous aggregates.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa em autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem

Citometria de fluxo de imagem para estudar a autoagregação microbiana

Os resultados demonstram que este método pode medir facilmente as diferenças na autoagregação em resposta aos açúcares da dieta em bactérias LAB. Ao separar os indivíduos dos agregados, o método permite calcular a porcentagem da população dos eventos de agregação de todos os eventos em resposta aos açúcares fermentáveis ou não fermentáveis da dieta. Além disso, foi possível medir se há diferenças no tamanho médio da população agregada entre os tratamentos.
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Este protocolo descreve uma abordagem quantitativa para medir a autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

Este estudo utilizou espécies de Lactobacillus como modelo para demonstrar a eficácia da análise de citometria de fluxo de imagem no estudo da autoagregação microbiana. O foco está na análise da resposta da autoagregação de espécies de Lactobacillus a carboidratos simples da dieta. Os métodos mais utilizados para medir a autoagregação são a fotometria espectral, que mede suspensões microbianas, turbidez ou densidade óptica, e as técnicas tradicionais de microscopia, como campo claro, contraste de fase e microscopia fluorescente.Ao falar sobre imagens de alto rendimento, um grande desafio experimental é a segmentação de evento único. Neste protocolo, é um único agregado. A citometria de fluxo de imagem aborda esse desafio com elegância e oferece aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para estudar a autoagregação.

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

530 visualizações.  Ben-Gurion University of the Negev. Este estudo utilizou espécies de Lactobacillus como modelo para demonstrar a eficácia da análise de citometria de fluxo de imagem no estudo da autoagregação microbiana. O foco está na análise da resposta da autoagregação de espécies de Lactobacillus a carboidratos simples da dieta. Os métodos mais utilizados para medir a autoagregação são a fotometria espectral, que mede suspensões microbianas, turbidez ou densidade óptica, e as técnicas tradicionais de microscopia, como camp...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando na pesquisa em autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.