Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Resumo

Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.

Resumo

Tratamento medicamentoso de animais inteiros é uma ferramenta essencial em qualquer sistema modelo para farmacológicos e químicos estudos genéticos. Injecção intravenosa (IV) é muitas vezes a forma mais eficaz e não invasivo de transporte de um agente de interesse. No peixe-zebra (

Protocolo

Parte 1. Preparação de material de injecção

1. Tg (globina: GFP) células:
2. Sangrar peixes doadores adultos usando ponteira 10ul revestido em heparina (1unit/ul) para pescar punção por trás de emalhar.
3. Aspirar glóbulos vermelhos e dispensar em tampão celular (0.9x PBS + 5% de SFB + 1% Pen / Strep).
4. Suspensão de células filtro sobre malha 40uM e determinar a concentração de células usando hemocitômetro como descrito por LeBlanc et al.
5. Spin down e ressuspender em tampão celular na concentração desejada de tal forma que o volume de injeção final não é mais do que 5ul. Aqui nós injetar 1,5-2000000 células / destinatário.
6. Para o, dextran Texas Red ®, dissolver o corante em DPBS para uma concentração final de injecção de 10-12 mg / mL. Plano para injetar 4 uL por peixe.

Parte 2. Injeção

1. Anestesiar peixes em tricaina (4.2ml (4mg/ml) peixes de água tricaine/100ml).
2. Lavar seringa Hamilton 3-4 vezes antes da injeção utilizando etanol 70%. Enxágüe 3-4 vezes com DPBS 0.9x.
3. Coloque os peixes lado dorsal para cima e virado para a direita na esponja úmida.
4. Segure a seringa Hamilton com a mão direita e com o dedo indicador sobre o êmbolo. Suavemente estabilizar o corpo do peixe com a mão esquerda.
5. Posição da agulha com o bisel voltado para cima de tal forma que se o olho do peixe s fosse um relógio, a agulha seria apontar para a posição 7:00 e em um ângulo de 45 graus para o peixe (figura 1).
6. Inserir a agulha delicadamente 1-2 mm em posição 7:00 e lentamente o êmbolo.
7. Permitir que os peixes na água para recuperar E3 fresco.
8. Lavar agulha, como descrito acima, entre as injeções de reagentes diferentes.
9. Solução Flick célula para ressuspender as células a cada poucos minutos para evitar aglomeração de células.
10. Manter o fluxo de peixe por 1 semana com mudanças de água diariamente para evitar a infecção. Mantemos peixe na água UTI para esse período (10 ml + casaco Estresse pemafix 5mL + melafix 5mL por 38 litros de água E3).

Parte 3. Resultados representante

Quando realizada corretamente, é possível visualizar material injetado, se tiver sido rotulado de alguma forma. Por exemplo, Tg (globina: GFP), as células vermelhas do sangue deve ser visto sob um microscópio fluorescente dissecção circulando na vasculatura do destinatário peixes casper logo após a injeção, como mostrado na figura 2. Da mesma forma, a injeção de um dextran 70kDa, conjugado com Texas Red ® pode ser visualizado na vasculatura de peixe transparente imediatamente após a injeção de retro-orbital (figura 3). Células de rim fluorescente de Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores também podem ser injetados retro-orbital em peixes irradiados casper destinatário. Estas células acabará casa até a medula destinatário (figura 4a) e pode então ir para repovoar o rim depois de várias semanas (figura 4b).

Se a injecção é muito raso ou o ângulo da agulha ignora a retro-orbital cavidade do seio venoso, material injetado pode ser visualizado pooling em torno do olho ou saindo dela. Alternativamente, se a injeção é muito profundas, os peixes podem sofrer danos tecido ou sangramento excessivo, mas eles ainda podem se recuperar. Quando realizada corretamente, a mortalidade após retro-orbital injecção deve ser inferior a 5% do peixe total injetado e sucesso de entrega para a corrente sanguínea deve ser superior a 90% do peixe total injetado.

Figura 1: Ilustração de retro-orbital técnica de injeção. O olho direito do peixe é representado como um relógio analógico em que os sete posição do relógio o corresponde ao local de injeção correta.

Figura 2: Tg (globina: GFP) glóbulos vermelhos circulantes na vasculatura da cauda de um peixe adulto casper três dias depois de retro-orbital injeção.

Figura 3: A injeção de sucesso de um dextran 70kDa conjugado com Texas Red ® usado como corante fluorescente produz vasculatura no peixe adulto transparente, casper e é facilmente visualizado utilizando microscopia de fluorescência padrão todo animal.

Figura 4a: Três dias após retro-orbital injeção de células de rim de todo medula Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, as células podem ser visualizados homing para a medula renal de peixes irradiados receptor adulto casper.

Figura4b: Quatro semanas após a retro-orbital injeção de células de rim de toda a medula da Tg (β-actina: GFP) de peixes doadores, o repovoamento do rim destinatário com células da medula do doador verde toda rim pode ser visualizado na irradiados peixes receptor adulto casper.

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Discussão

Retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto dá a maior eficiência de entrega de material injetado na corrente sanguínea com a menor incidência de mortalidade. Devido à natureza do local de injeção, a punção parece curar rapidamente, diminuindo a ocorrência de infecção e da quantidade de perda de sangue. O site pode até ser injetado repetidamente durante um curto período de tempo para injeções diárias de medicamentos, por exemplo.

Grandes quantidades de droga deve ser compr...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	2106	Preweighed vial of 300 USP units
Tricaine-S	Western Chemical		MS-222
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Dextran, Texas Red®	Molecular Probes, Life Technologies	D1830
E3			5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2
Microliter Syringe	Hamilton Co	80300	701N 10uL SYR (26s/2”/2)