Ретро-орбитальный инъекций у взрослых данио рерио

Резюме

Здесь мы показываем, как это сделать ретро-орбиту у взрослых рыбок данио.

Аннотация

Медикаментозное лечение целых животных является важным инструментом в любой модели системы для фармакологической и химической генетических исследований. Внутривенно (IV) инъекции часто является наиболее эффективным и неинвазивной формой доставки агентов, представляющих интерес. В данио (

протокол

Часть 1. Подготовка материала инъекции

1. Tg (глобина: GFP) клеток:
2. Bleed взрослых рыб доноров использованием 10ul кончиком пипетки покрытие гепарином (1unit/ul), чтобы проколоть рыбу за жабры.
3. Аспирируйте красных кровяных клеток и обойтись в ячейке буфера (PBS 0.9x + 5% ЭТС + 1% Pen / Strep).
4. Фильтры суспензии клеток за 40uM сетки и определения концентрации клеток с использованием гемоцитометра, как описано выше по Лебланк и соавт.
5. Спином вниз и ресуспендируют в ячейке буфера при нужной концентрации, что окончательный объем инъекций составляет не более 5ul. Здесь мы вводим 1,5-2 млн. кл / получателя.
6. Для декстран, Texas Red ®, растворить краситель в DPBS для конечной концентрации инъекции 10-12 мг / мл. План для введения 4 мкл на рыбу.

Часть 2. Инъекция

1. Обезболить рыбы в tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml рыбы вода).
2. Вымойте Гамильтон шприца 3-4 раз перед инъекцией с использованием 70% этанола. Промыть 3-4 раза с 0,9 x DPBS.
3. Место рыб спинной стороной вверх и вправо на влажной губкой.
4. Держите шприц Гамильтон со своей правой рукой и указательным пальцем на поршень. Аккуратно стабилизировать тело рыбы с левой рукой.
5. Расположите иглу с коническими вверх, что если глаз с рыбой были часы, стрелка будет указывая на 7:00 позиции и на 45 градусов к рыбе (рис. 1).
6. Осторожно введите иглу 1-2 мм в 7:00 позицию и медленно нажмите поршень.
7. Разрешить рыбы для восстановления в пресной воде E3.
8. Вымойте иглы, как описано выше, между инъекциями различных реагентов.
9. Флик клетка решение для ресуспендирования клетки каждые несколько минут, чтобы предотвратить слипание ячейки.
10. Хранить рыбу с потоком в течение 1 недели с ежедневными изменениями воды, чтобы избежать инфекции. Мы продолжаем рыба в воде ICU за этот период (10 мл Стресс пальто + 5 мл + 5 мл pemafix MelaFix на 38 литров воды E3).

Часть 3. Представитель Результаты

Когда выполнены правильно, то можно представить себе вводили материал, если он был назван в некотором роде. Например, Tg (глобина: GFP) эритроцитов следует рассматривать под флуоресцентного микроскопа рассечение, циркулирующей в сосудистой рыбы получателя Каспер вскоре после инъекции, как показано на рисунке 2. Кроме того, введение 70kDa декстран, сопряженных с Texas Red ® могут быть визуализированы в сосудистую прозрачной рыбы сразу же после ретро-орбиту (рис. 3). Флуоресцентные клетки почки от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы также может быть введен ретро-орбитально в облученной рыбы получателя Каспер. Эти клетки в конечном итоге домой к получателю мозга (рис. 4а), а затем может перейти к населить почек после нескольких недель (рис. 4б).

Если инъекция слишком мелко или угол иглы обходит ретроорбитального венозных синусов полости, вводимый материал может быть визуализированы объединения вокруг глаз или вытекающих из него. Кроме того, если инъекция слишком глубоко, рыбы могут возникнуть повреждения тканей или чрезмерное кровотечение, хотя они все еще может восстановиться. При правильном выполнении смертности после ретро-орбиту должно быть не менее 5% от общего числа вводили рыбу и успех доставки крови должно быть больше 90% от общего числа вводили рыбу.

Рисунок 1: Иллюстрация ретро-орбиту техники. Правый глаз рыбы представляется как аналоговые часы, в которых 7:00 позиция соответствует правильном месте инъекции.

Рисунок 2: Tg (глобина: GFP) красные кровяные клетки, циркулирующие в сосудистую хвоста взрослой рыбы Каспер три дня после ретроорбитального инъекции.

Рисунок 3: Успешное введение 70kDa декстран конъюгированных с Texas Red ® используется как краситель производит люминесцентные сосудистую в прозрачном взрослых рыб, Каспер и легко просматривать с помощью стандартных целом микроскопии флуоресценции животного.

Рисунок 4а: три дня после ретро-орбиту целой почки клеток костного мозга от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы, клетки могут быть визуализированы самонаведения для почек мозга облученных рыбы Каспер получателя взрослых.

Фигура4b: четыре недели после ретро-орбиту целой почки клеток костного мозга от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы, заселение реципиента почки с зелеными доноров целые клетки мозга почек могут быть визуализированы в облученной рыбы Каспер получателя взрослых.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Ретро-орбиту у взрослых данио дает наибольшую эффективность доставки вводят материал в кровоток с самой низкой частоты смертности. Из-за характера инъекции месте прокола кажется заживают быстро, уменьшая возникновения инфекции и объем кровопотери. Сайте, могут быть даже неоднократно...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	2106	Preweighed vial of 300 USP units
Tricaine-S	Western Chemical		MS-222
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Dextran, Texas Red®	Molecular Probes, Life Technologies	D1830
E3			5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2
Microliter Syringe	Hamilton Co	80300	701N 10uL SYR (26s/2”/2)