Modelo murino de CD40-ativação de células B

Resumo

Neste vídeo, demonstramos o procedimento de ativação CD40-e expansão de células B murino de esplenócitos de camundongos C57BL / 6, que pode ser usado como um modelo de células apresentadoras de antígenos (APC) para estudar a indução de imunidade.

Resumo

A investigação sobre células B CD40 mostrou que melhora a sua capacidade de ativação apresentação de antígenos. Quando estimuladas com interleucina-4 e CD40 ligante (CD40L), células B humano pode ser expandido sem dificuldades a partir de pequenas quantidades de sangue periférico dentro de 14 dias para grandes quantidades de altamente pura CD40 células-B (> 10

Protocolo

O protocolo para a geração de células CD40 de murino ativado B (mCD40B) de esplenócitos é dividido em duas partes: Parte A demonstra a preparação do ligante CD40 de murino (CD40L) expressando células HeLa (tmuCD40L HeLa), que será utilizado como placa obrigado células alimentadoras. Parte B descreve a real cultura CD40-B murinos.

A. Preparação de células alimentadoras (tmuCD40L HeLa)

O HeLa tmuCD40L é uma linha de células epiteliais humanas aderente, que nunca deve tornar-se completamente confluentes. As células são, portanto, dividido por duas vezes por semana. Cultura há mais de seis semanas não é recomendado.

1. Remova o meio de idade a partir da cultura primária com uma pipeta estéril e lavar as células com 10 mL de PBS 1x. Aspirar o PBS após a lavagem.
2. Adicionar 4 mL de 1x Tripsina / EDTA em um frasco de 75 cm ² por 10-15 minutos a 37 ° C. Use tocando suave para retirar as células.
3. Adicionar 10 mL de meio de tipo selvagem e giratória suavemente para parar a digestão com tripsina.
4. Transferir a suspensão de células em um tubo de 50 mL com uma pipeta estéril e girar a células para baixo a 265 xg por 7 minutos.
5. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de tipo selvagem. Conte o número de células de uma alíquota da suspensão de células e preparar três tubos de 50 mL com o número adequado de células:
   1. 2,5 x 10 ⁶ células para subcultura
   2. 0,4 x 10 ⁶ células / poço de irradiação utilizadas para a cultura de células murinas CD40-B
   3. restante para congelar (se necessário).
6. Spin the células para baixo a 265 xg por 7 minutos.
7. Remover o sobrenadante.
   1. Para subcultura: ressuspender 2,5 x 10 ⁶ células em 10 mL de médio seleção em um frasco de 75 centímetros de cultura de células ² (densidade celular de 2,5 x 10 ⁵ células / mL) e incubar as células a 37 ° C com 5% de CO _2. Dividir as células duas vezes por semana.
   2. Para a cultura de células murinas CD40-B: Você precisa de 2,4 x 10 ⁶ células para uma placa de 6 poços. Ressuspender as células HeLa em meio tmuCD40L tipo selvagem, a uma densidade de 0,2 x 10 ⁶ células / mL e irradiar-los em 78 Gy. Placa de 2 mL da suspensão de células em cada poço e incube-os a 37 ° C com 5% de CO _2. Utilize este placas preparado para a estimulação de células B, quando as células HeLa são tmuCD40L aderente (pelo menos 4 horas: verificar a aderência do uso do microscópio, não espere mais de 24 h para iniciar a estimulação de células B). (Continue com B.)

B. murino CD40-cultura de células B

I. Elaboração de esplenócitos para CD40-estimulação (dia 0):

Por favor note: antes de continuar determinar que as células de alimentação são aderentes. Sempre adicionar novas soluções de murino imediatamente interleucina-4, β-mercaptoetanol e ciclosporina A para o meio de crescimento antes do uso.

1. Dissecar baço de camundongos C57BL / 6 (haplótipo H-2b) e lavá-la duas vezes em 10-20 mL DMEM suplementado com Gentamicina [15μg/mL], transferindo-o com uma ponta de pipeta 10 ml de um tubo para outro. Evitar a transferência de contaminantes (por exemplo, o cabelo) do mouse. Mince baço por passagem através de um filtro de células (100μm) e enxaguar com outra peneira de 10 mL de meio. Spin down esplenócitos a 265 xg por 7 min em temperatura ambiente, ressuspender-los em 7ml muCD40-B médio de células, e os linfócitos separado por centrifugação Ficoll densidade. Para fazê-lo células da camada em 5 mL Mouse-Pancoll (pré-aquecido em temperatura ambiente) em um tubo de 15 ml e centrifugar a 450 xg por 30 min sem freio à temperatura ambiente.
2. Empate fora de a maioria da camada superior, deixando intacta a camada de linfócitos na interface. Transferência de camada de linfócitos a um tubo de 50 mL frescos, lave uma vez com 30mL DMEM com Gentamicina [15μg/mL] para baixo, girando a 265 xg por 7 min para remover outras células. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de mCD40-B médio de lavar roupa. Determinar o número de células em uma alíquota da suspensão de células. Determine o número de células por contagem uma alíquota da suspensão de células.
3. Spin para baixo a quantidade necessária de células em 265 xg por 7 minutos. Para uma placa de 6 poços 5 x 10 ⁶ células / poço são necessários, portanto, 30 x 10 ⁶ células por placa.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender os linfócitos em 1,25 x 10 ⁶ células / mL em mCD40-B meio de cultura fresco suplementado com 1 U / mL de IL-4 como fator de crescimento, 100 mM β-mercaptoetanol e 0,63 mcg / mL A ciclosporina para prevenir conseqüência de células-T (concentrações indicados referem-se a um meio de cultura mL!).
5. Retire o sobrenadante da placa de 6 poços de pré-incubados com células HeLa tmuCD40L.
6. Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de linfócitos (1,25 x 10 ⁶ células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
7. Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO _2.
8. No dia 3 reculture as células (Continue com II.1.).

II. Subcultura de células mCD40B (dia 3 e, em seguida, duas vezes por semana):

1. Colheita aglomerado de células mCD40B por vigorosamente pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL e piscina-los em um tubo de 50 mL.
2. Girar em 265 xg por 7 minutos e substituir completamente o sobrenadante com mCD40-B médio de lavar roupa. Contando a quantidade de células de uma alíquota, gire a células para baixo a 265 xg por 7 minutos. Ressuspender as células em mCD40B mCD40-B meio de cultura a uma concentração de 0,75 x 10 ⁶ células / mL.
3. Adicionar novas soluções de murino interleucina-4 em uma concentração de 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol β-M e 0,63 mcg / mL ciclosporina A ao meio.
4. Remover o sobrenadante de uma placa de 6 poços de pré-incubados com células irradiadas tmuCD40L HeLa.
5. Delicadamente adicionar 4 mL da suspensão de células mCD40B (0,75 x 10 ⁶ células / mL) a cada poço da placa de 6 poços.
6. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO _2.
7. Novamente subcultura as células a cada 3-4 dias para acabar com alta pureza murino células CD40-B ativadas após um total de 14 dias.

C. Resolução de problemas: O que se CD40-B células não crescem?

1. Você tem verificado para CD40 ligante expressão de células de alimentação?
2. São a placa-bound células alimentadoras usado para a estimulação com mais de 24 horas?
3. Existe uma contaminação com micoplasma?
4. Foi a solução interleucina-4 utilizada para a suplementação recém descongeladas e que teve a atividade biológico adequado?
5. Foi β-mercaptoetanol e ciclosporina A adicionado na concentração correta?

Figura 1a.

Figura 1b.

Figura 1d.

Figura 2.

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Discussão

Modificações deste protocolo são possíveis, especialmente quanto à origem do estímulo-CD40 e do tipo de estirpe do rato utilizado, rendendo também na geração eficiente de células CD40 de murino B ativadas. Ahmadi et al. têm mostrado resultados semelhantes para fibroblastos de rato transfectadas com murino CD40 ligante. Nesta apresentação contexto de xeno-antígeno pode ser excluída com certeza, mas estudos intensivos em matéria de segurança e toxicidade in vivo não deu sinais de inflamação ou...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alimentador celular médio do tipo selvagem	Alimentador meio de seleção de célula
Reagente	Concentração	Reagente	Concentração
RPMI 1640		RPMI 1640
L-Glutamina	300 mcg / mL	L-Glutamina	300 mcg / mL
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamicina	15 mcg / mL	Gentamicina	15 mcg / mL
		Higromicina B	0,2 mg / mL

mCD40-B médio de lavar	mCD40-B meio de cultura
Reagente	Concentração	Reagente	Concentração
D-MEM		D-MEM
L-Glutamina	580 mcg / mL	L-Glutamina	580 mcg / mL
Glicose	4,5 mg / mL	Glicose	4,5 mg / mL
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamicina	15 mcg / mL	Gentamicina	15 mcg / mL
		MEM	0,1 mM (1x)
		FBS	10%

Reagente	Companhia	Despacho n.
RPMI 1640	Invitrogen Gibco	REF 21875
D-MEM	Invitrogen Gibco	REF 41965
Dulbeccos PBS (10x)	PAA	Cat Não H15-011
Gencin	Selecione Delta	Arte Sem 7395800
FBS	LONZA	Cat Não DE14-802C
Tampão HEPES	PAA	Cat Não S11-001
MEM NEAA	Invitrogen Gibco	REF 11140
Higromicina B	PAA	Cat Não P02-015
Recombinante murino Interleucina-4	Immunotools	Cat Não 12340045
Ciclosporina A	Novartis	Cat Não NDC 0078-0109-01
Tripsina / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco	REF 15400-054

Reagente	Companhia	Despacho n.
Pipeta estéril dicas	Sarstedt
6-bem placa	NUNC	Não Cat 140675
50mL tubo cônico	BD Falcon ™	Não Cat 352070
Frasco de cultura de tecidos	Sarstedt	Cat Não 83.1813.002