Мышиной модели CD40-активации В-клеток

Резюме

В этом видео мы продемонстрируем процедуру активации CD40 и расширение мышиных клеток из спленоцитов C57BL / 6 мышей, которые могут быть использованы в качестве модели антиген-представляющих клетки (АПК) для изучения индукции иммунитета.

Аннотация

Исследование клеток показало, что CD40 активации улучшает их презентации антигена мощности. При стимуляции с интерлейкина-4 и CD40 лиганда (CD40L), человеческих клеток может быть расширена без трудностей из небольшого количества периферической крови в течение 14 дней до очень большого количества высоко-чистые CD40-лимфоцитов (> 10

протокол

Протокол поколение мышиных CD40-активированных В-клеток (mCD40B) из спленоцитов делится на две части: часть демонстрирует подготовку мышиной CD40 лиганда (CD40L), выражающая HeLa клетки (tmuCD40L HeLa), который будет использоваться в качестве пластинчатых связаны фидерных клеток. Часть В описывает фактические мышиной CD40-B культуры.

А. Подготовка фидерных клеток (tmuCD40L HeLa)

TmuCD40L HeLa является сторонником человеческих эпителиальных клеточных линий, которые никогда не должны стать полностью вырожденная. Клетки, таким образом, разделил два раза в неделю. Культивирование в течение более 6 недель не рекомендуется.

1. Удалить старые среды от первичной культуры с стерильной пипетки и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Аспирируйте PBS после мытья.
2. Добавить 4 мл 1x трипсина / ЭДТА в 75 см ² колбы в течение 10-15 минут при температуре 37 ° C. Используйте нежное нажмите, чтобы отделить клетки.
3. Добавьте 10 мл дикий тип среды и поворота осторожно, чтобы остановить пищеварения трипсином.
4. Передача клеточной суспензии в 50 мл трубки с стерильной пипетки и спина ячейки вниз на 265 мкг в течение 7 минут.
5. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл дикий тип среды. Граф количества клеток аликвоту суспензии клеток и подготовить три 50 мл трубки с соответствующим количеством клеток:
   1. 2,5 х 10 ⁶ клеток для субкультуры
   2. 0,4 х 10 ⁶ клеток / лунку для облучения используется для мышиного CD40-B культуре клеток
   3. Остальная заморозить (при необходимости).
6. Спиновые клетки вниз на 265 мкг в течение 7 минут.
7. Удалить супернатант.
   1. Для субкультивирования: ресуспендирования 2,5 х 10 ^{6 клеток} в 10 мл выбор среды в 75 см ² колбы культуры клеток (плотность клеток 2,5 х 10 ⁵ клеток / мл) и инкубировать клетки при 37 ° C с 5% CO _2. Сплит клетки два раза в неделю.
   2. Для мышиного CD40-B культуре клеток: Вам нужно 2,4 х 10 ^{6 клеток} на один 6-луночный планшет. Ресуспендируют tmuCD40L клетках HeLa в дикий тип среды с плотностью 0,2 х 10 ^{6 клеток} / мл и облучать их на 78 Гр. Пластина 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать их при температуре 37 ° C с 5% CO _2. Используйте этот подготовленные пластины для В-клеток при стимуляции tmuCD40L HeLa клетки приверженцем (по крайней мере 4 часа: проверять соблюдение использованием микроскопа; не ждать более 24 ч до начала В-клеточной стимуляции). (Продолжить с Б.)

Б. мышей CD40-B культуре клеток

I. Подготовка спленоцитов для стимуляции CD40 (день 0):

Обратите внимание: перед тем как продолжить констатировать, что фидерных клеток являются приверженцем. Всегда добавляйте свежие решения мышиного интерлейкина-4, β-меркаптоэтанол и циклоспорин в питательную среду непосредственно перед употреблением.

1. Рассеките селезенки C57BL / 6 мышей (гаплотип H-2b) и мыть дважды в 10-20 мл DMEM дополнен гентамицин [15μg/mL] путем переноса его с кончика пипетки 10 мл из одной галереи в другую. Избегайте передачи загрязняющих веществ (например, волосы) мыши. Фарш селезенки, пропуская ее через ячейки сетчатого фильтра (100 мкм) и промыть фильтр с еще 10 мл среды. Спином вниз спленоцитов в 265 мкг в течение 7 минут при комнатной температуре, ресуспендируют их в 7 мл muCD40-B клеточной среде, так и отдельные лимфоциты путем центрифугирования плотности Ficoll. Для этого слой клеток на 5 мл Mouse-Pancoll (предварительно нагретой при комнатной температуре) в 15 мл и трубки центрифуги при 450 мкг в течение 30 минут без тормоза при комнатной температуре.
2. Слить большую часть верхнего слоя, оставляя нетронутой лимфоцитов слой на границе раздела. Передача лимфоцитов слой свежей 50 мл трубки, мыть один раз с 30 мл DMEM с гентамицин [15μg/mL] за счет остановки на 265 мкг в течение 7 минут, чтобы удалить другие клетки. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 10 мл mCD40-B средний стирки. Определить номер ячейки в аликвоту клеточной суспензии. Определить число клеток путем подсчета аликвоты клеточной суспензии.
3. Спином вниз необходимое количество клеток в 265 мкг в течение 7 минут. Для 6-луночный планшет 5 х 10 ⁶ клеток / лунку необходимо, таким образом, 30 х 10 ^{6 клеток} на чашку.
4. Удалить супернатант и ресуспендируйте лимфоцитов на 1,25 х 10 ^{6 клеток} / мл в mCD40-B свежей питательной среды с добавлением 1 ЕД / мл интерлейкина-4 в качестве фактора роста, 100 мкМ β-меркаптоэтанол и 0,63 мкг / мл циклоспорин для предотвращения результатом Т-клеток (С учетом концентрации относятся к одной среды культуры мл!).
5. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с клетками HeLa tmuCD40L.
6. Аккуратно добавить 4 мл лимфоцитов подвески (1,25 х 10 ⁶ клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
7. Инкубируйте планшет при 37 ° C с 5% CO _2.
8. На 3-й день reculture клеток (Продолжить с II.1.).

II. Субкультура клеток mCD40B (день 3, а затем два раза в неделю):

1. Урожай mCD40B клетка кластера энергично пипетирования вверх и вниз с 10 мл пипетки и бассейном их в 50 мл трубки.
2. Спином вниз на 265 мкг в течение 7 минут и полностью заменяют собой супернатант с mCD40-B средний стирки. При подсчете количества ячейки аликвоту, спина ячейки вниз на 265 мкг в течение 7 минут. Ресуспендируют mCD40B клеток в mCD40-B культуральной среде при концентрации 0,75 х 10 ^{6 клеток} / мл.
3. Добавьте свежие решения мышиной интерлейкина-4 в концентрации 1 ЕД / мл, 100 мкМ β-меркаптоэтанол и 0,63 мкг / мл циклоспорина в среду.
4. Удалить супернатант из 6-луночный планшет предварительно инкубировали с облученным tmuCD40L клетках HeLa.
5. Аккуратно добавить 4 мл суспензии mCD40B ячейки (0,75 х 10 ⁶ клеток / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет.
6. Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO _2.
7. Снова субкультуры клетки каждые 3-4 дней, чтобы закончить с высокой чистоты мышиной CD40 активированных В-клеток после общей сложности 14 дней.

C. Устранение неисправностей: Что делать, если CD40-B клетки не растут?

1. Проверяли ли Вы для CD40 лиганд выражение фидерных клеток?
2. Являются ли пластинчатый питатель связаны клетки, используемые для стимуляции старше 24 часа?
3. Есть ли загрязнение микоплазмой?
4. Был интерлейкина-4 раствор, используемый для добавки свежей талой и сделал это есть соответствующее биологической активности?
5. Был β-меркаптоэтанол и циклоспорин добавили в правильной концентрации?

На рисунке 1а.

На рисунке 1б.

Рис 1d.

Рисунок 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Модификации данного протокола возможны, особенно в отношении происхождения CD40-стимул и тип мыши напряжение используется, также уступая в эффективной генерации мышиной CD40-активированных В-клеток. Ахмади соавт. показали аналогичные результаты для мышиных фибробластов, трансфицирован?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Устройство подачи ячейки диких среднего типа	Устройство подачи клеточной селекции средой
Реагент	Концентрация	Реагент	Концентрация
RPMI 1640		RPMI 1640
L-глютамин	300 мкг / мл	L-глютамин	300 мкг / мл
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 мМ	HEPES	10 мМ
Гентамицин	15 мкг / мл	Гентамицин	15 мкг / мл
		Гигромицину B	0,2 мг / мл

mCD40-B промыванием	mCD40-B культуральной среде
Реагент	Концентрация	Реагент	Концентрация
D-MEM		D-MEM
L-глютамин	580 мкг / мл	L-глютамин	580 мкг / мл
Глюкоза	4,5 мг / мл	Глюкоза	4,5 мг / мл
HEPES	10 мМ	HEPES	10 мМ
Гентамицин	15 мкг / мл	Гентамицин	15 мкг / мл
		MEM	0,1 мм (1x)
		FBS	10%

Реагент	Компания	Приказ №
RPMI 1640	Invitrogen Gibco	REF 21875
D-MEM	Invitrogen Gibco	REF 41965
Dulbeccos PBS (10x)	ПАА	Cat Нет H15-011
Gencin	Дельта Выберите	Нет искусства 7395800
FBS	Lonza	Кошка не DE14-802C
HEPES буфера	ПАА	Cat Нет S11-001
MEM NEAA	Invitrogen Gibco	REF 11140
Гигромицину B	ПАА	Cat Нет P02-015
Рекомбинантный интерлейкин мышей-4	Immunotools	Cat Нет 12340045
Циклоспорин	Novartis	Кошка не NDC 0078-0109-01
Трипсина / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco	REF 15400-054

Реагент	Компания	Приказ №
Стерильные наконечники	Sarstedt
6-луночный планшет	Nunc	Cat Нет 140675
50 мл коническую трубку	BD Сокол ™	Cat Нет 352070
Колбу культуры ткани	Sarstedt	Кошка не 83.1813.002