Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Resumo

Este artigo ilustra como usar corretamente o BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmidial em células epidérmicas de cebola e como testar para interações proteína-proteína em células de cebola com base no princípio de Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC)

Resumo

Investigação da função dos genes em diversos organismos baseia-se no conhecimento de como os produtos de genes interagem uns com os outros em seu ambiente normal de celular. O Bimolecular Fluorescência de Complementação Assay (BiFC)

Protocolo

I. preparação Plasmid

O DNA plasmídeo usado para bombardeio deve ser de alta pureza e em uma concentração de 500ng/μl ou superior. Para BiFC envolvendo duas construções plasmídeo, 25 mcg de cada plasmídeo é necessário. Em outras palavras, 1:1 molar dos dois plasmídeos devem ser misturadas para dar origem a 50 mg DNA total plasmídeo para a preparação de cartuchos. Esteja consciente de que a adição de mais DNA do que 50 mg pode causar aglomeração das partículas de ouro e deve ser evitado. Comercialmente disponíveis kits de extração de DNA plasmídeo são recomendados para isolar DNA plasmídeo.

Vetores plasmídeo deve ser relativamente pequeno em tamanho, como pUC19. Nós SEU clonado e LUH cDNA em pUC19-SPYNE e pUC19-Spyce, respectivamente ^3. Vetores binários para Agrobacterium mediada transformação são grandes demais e inadequado para o bombardeio.

II. Cartucho de preparação

Preparação cartucho envolve as partículas de ouro com revestimento de DNA plasmidial e carregá-los em tubos de plástico que é posteriormente cortada em pedaços meia polegada de comprimento, que pode ser carregado no gene titulares cartucho de arma. Preparação cartucho é descrito em grandes detalhes em um artigo separado Jove ⁴ e é, portanto, não descritos aqui. Para bombardeio de células da cebola, recomendamos mistura de 50 mg de DNA plasmidial com 12,5 mg de partículas de ouro por preparação, que rende cerca de até 50 cartuchos de 1 mg DNA/0.25 mg de ouro / cartucho. Cada cartucho é de um tiro. As partículas de ouro pode ser 0,6 mm ou 1,0 m de diâmetro (Cat # 1652262 ou Cat # 1652263; Biorad). Também recomendamos o uso de 0,5 mg / ml solução PVP para a preparação do cartucho. Para BiFC, combine os dois DNAs plasmídeo de cada parceiro interagindo putativo na preparação mesmo cartucho.

Após a preparação do cartucho, é importante para testar os cartuchos, disparando os cartuchos recém-feitos a uma pressão de hélio entre 150 a 200 psi em um Parafilm quadrado que é enrolado em torno de uma placa de Petri. Isso irá testar se as partículas de ouro podem ser movidos de forma eficiente dos cartuchos, você deve ver partículas de ouro desmaiar na Parafilm. Isso lhe dá uma idéia da área que cada tiro irá abranger. Você pode observar diferentes quantidades de partículas de ouro impelido para o Parafilm em diferentes pressões de hélio (a faixa 150-200 psi). Se não há diferença significativa, escolha a menor pressão de bombardeio.

III. Preparar os tecidos de cebola

No dia da gravação, retire a pele externa de uma cebola grande amarelo. Usando uma lâmina limpa e afiada, corte 4-5 camadas profundas uma área retangular de cerca de 2 X 8 cm. Retire o tecido retangular cebola, descarte o exterior duas camadas, corte as camadas restantes de cebola em pedaços sobre 2x1.5 cm. Coloque os pedaços de cebola em um prato de Petri contendo papel de filtro (Whatman 3MM de papel cortado em círculos) umedecido com água estéril. Cubra o prato de Petri e eles estão prontos para ir.

IV. Bombardeamento

1. Carregar os cartuchos para o branco titulares cartucho redondo. Cartuchos contendo diferentes construções plasmídeo deve ser carregado em titulares cartucho diferente. Cada suporte do cartucho pode armazenar até 12 cartuchos por 12 tiros.
2. Insira a bateria e o forro barril fresco no Gun Gene Helios. Certifique-se que tanto o forro do cano da arma e tem respectivos o-rings em anexo.
3. Primeiro, insira um cartucho vazio titular na arma gene, com a marca # 12 no suporte do cartucho de frente para o topo da arma. Suporte do cartucho avançar uma ou duas vezes para ter certeza que está inserido corretamente.
4. Anexar arma para o tanque de hélio e ajustar a pressão entre 150 a 200 psi.
5. Usa protetor auricular e arma de fogo algumas vezes com o suporte do cartucho vazio para limpar a câmara da arma e para se certificar de que a pressão está estável.
6. Remova o suporte do cartucho vazio e coloque um suporte do cartucho carregado. Avançar o suporte do cartucho para que o cartucho que você deseja para o fogo está posicionado na parte inferior (06:00) do suporte do cartucho. Fotografar um pedaço de cebola aqui fornece uma forma de controle negativa para fluorescência de fundo.
7. Coloque os pedaços de cebola no meio de um prato vazio Petri com a camada mais interna da cebola voltada para cima. Resto do forro a arma gene barril na placa de Petri e disparar a arma pressionando o botão lateral, puxando o gatilho. Transfira a cebola bombardeados com uma placa de Petri contendo papel filtro úmido 3MM.
8. Avançar para o próximo cartucho e fogo um pedaço de cebola diferente. Repita este passo até 4-5 pedaços de cebola são filmadas. Cada pedaço de cebola é baleado uma vez.
9. Mudar para um suporte do cartucho carregado com diferentes cartuchos contendo uma combinação plasmídeo ou diferentes diferentes plasmídeo. Lembre-se de mudar o forro barrils bem para evitar a contaminação. Atire 4-5 pedaços de cebola.
10. Após bombardeio, retornar todas as cebolas aos pratos pertinência. Cobrir as placas de Petri com tampa. Envolvê-los com Parafilm para evitar a secagem. Incubar os pedaços de cebola em temperatura ambiente no escuro por 16-48 horas.
11. Desligue a pressão do gás e liberação antes de separar a arma gene do tanque de hélio. Liner desapertar o barril, e remover o suporte do cartucho e os cartuchos usados ​​(ou não).
12. Limpeza titulares cartucho e forros barril, submergindo-os num copo com água e sabão. Coloque o copo num banho e sonicador sonicate por 20 minutos. Depois, lave-os com água para remover todos os resíduos de sabão. Mergulhe-os em etanol 70% por uma hora e depois seque-os sobre papel absorvente.

V. Observação

1. Após incubação pedaços de cebola bombardeados durante 16-20 horas à temperatura ambiente, podemos observar GFP ou YFP fluorescência usando um microscópio de fluorescência, como a Zeiss Axio Observer.z1 utilizados neste estudo.
2. Use uma pinça com extremidades planas lentamente a casca de uma única camada celular fora da epiderme interna da cebola (a camada que se confronta diretamente com a arma durante o bombardeio). Coloque as cascas em uma gota de água em um slide. Adicionar lamela mas tenha cuidado para minimizar bolhas.
3. Em campo claro do microscópio, verifique primeiro para streaming citoplasmática para garantir que as células estão vivas. Para isso, expor o slide para a luz brilhante campo por alguns minutos para aquecer o tecido de cebola e depois olhar para plastídios em movimento. Streaming de citoplasmática nem sempre é fácil de ver, por isso não desanime se você não pode ver nenhuma.
4. Para a detecção de fluorescência, use a excitação apropriada e filtros de detecção de GFP ou YFP. É importante incluir controles negativos, tais como pedaços de cebola tiro com um plasmídeo não-fluorescente. Sinais fracos amarela pode aparecer a partir de células feridos, bolhas de ar, ou detritos. Também é importante incluir controlos positivos. Um plasmídeo contendo repórter constitutivamente expressa fluorescentes, como 35S:: GFP é um excelente controle positivo. Sinais visíveis a partir de células GFP cebola epidérmica (Figura 1A, D) indicou que os cartuchos, os tecidos, cebola e os disparos de armas gene está devidamente preparado e executado. Posteriormente, observou-se as interações entre SEU-pSPYNE e LUH-pSPYCE em pedaços de cebola bombardeados com cartuchos contendo uma mistura de 35S:: SEU-pSPYNE e 35S:: LUH-pSPYCE DNAs. Fluorescência YFP fraca foi observada no núcleo só (Figura 1 B, E), indicando a interação física direta entre SEU LUH e que trouxe os fragmentos YFP dividir juntos no núcleo. Note que o sinal da YFP BiFC é significativamente mais fraca do que o sinal da GFP 35S:: GFP.

Resultados representante

Em nosso estudo aqui relatado, o 35S:: GFP controle positivo plasmídeos emite fluorescência forte que preenche toda a célula, incluindo tanto o núcleo eo citoplasma (Figura 1A, D). Proteína GFP é pequeno o suficiente para difundir para o núcleo, sem um sinal de localização nuclear. Em contraste, SEU e LUH são dois fatores de transcrição de Arabidopsis mostrado anteriormente para interagir em uma levedura híbrida de dois ensaio ^2. SEU-pSPYNE (SEU fundida ao fragmento N-terminal da YFP) e LUH-pSPYCE (SEU fundida ao fragmento N-terminal da YFP), ambos muito grande para a difusão para o núcleo, contêm sinais de localização nuclear ^2,5. O sinal detectado YFP fluorescente no núcleo da célula da cebola (Figura 1 B, E) indica que SEU-pSPYNE e LUH-pSPYCE podem interagir em núcleos de cebola. Nenhum sinal fluorescente é detectado em cebolas bombardeados com mix de pSPYNE plasmídeo vetor plasmidial contendo o fragmento N-terminal da YFP e LUH-pSPYCE (Figura 1C, F).

O BiFC mediada YFP fluorescência é significativamente mais fraca do que a fluorescência da GFP-mediada da 35S:: GFP plasmídeo. Em nosso estudo, eles também mostraram localização subcelular diferente (compare com a Figura 1A B). Além disso, o número de células fluorescentes é significativamente menor para BiFC, como BiFC só funciona quando ambos os plasmídeos parceiro entrar com sucesso e são expressos nas células da cebola mesmo.

Figura 1. Fluorescente (A, B, C) ​​e de campo claro (D, E, F) imagens de células de cebola bombardeados com diferentes construções de plasmídeos. (A) e (D), as células da cebola bombardeados com 35S:: GFP. GFP difunde por todo o citoplasma eo núcleo. (B) e (E), as células da cebola bombardeados com igual mistura molar de 35S:: SEU-pSPYNE (SEU fundida ao fragmento N-terminal da YFP) e 35S:: LUH-pSPYCE (LUH fundida ao fragmento C-terminal ) DNA plasmidial. Uma interação entre SEU-pSPYNE e LUH-pSPYCE é mostrado por um núcleo fluorescente. (C) e (F), um controle negativo mostrando células de cebola bombardeados com misturas de vetor pUC19-SPYNE e LUH-pSPYCE plasmids. Nenhum sinal fluorescente é detectado.

Discussão

1. Para usuários de primeira vez, recomendamos a prática de todo o processo, desde a preparação do cartucho para observação, com um plasmídeo repórter única constitutiva, como 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Usamos um 35S:: GFP plasmídeo obtido a partir de drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning ⁶ (Figura 1A, D). O gene cartuchos de tiro controle vendido a RioRad (Cat 165-2244) não são adequados para as plantas.
2. Para BiFC, um segundo controle positivo é necessário, que deve ser composto de dois conhecidos parceiros in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yellow onion	Any Supplier
Helios Gene Gun	Bio-Rad
Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP	Zeiss, Nikon, Olympus