Segmentação Olfactory Neurônios Bulb Usando Combinado In Vivo Eletroporação e Gal4-Based Enhancer Lines Armadilha Zebrafish

Resumo

A resolução temporal e espacial das manipulações genéticas determina o espectro de fenômenos biológicos que possam perturbar. Aqui usamos temporal e espacialmente discreta In vivo Eletroporação, combinado com linhagens transgênicas de peixe-zebra, para induzir a expressão de um transgene GFP especificamente nos neurônios do bulbo olfativo desenvolvimento.

Resumo

Na eletroporação in vivo é um método poderoso para a entrega de plasmídeos DNA expressão, RNAi reagentes e morfolino oligonucleotídeos anti-senso a regiões específicas de embriões em desenvolvimento, incluindo os de C. elegans, pinto, Xenopus, peixe-zebra, e mouse ^1. Em peixes-zebra, no eletroporação in vivo tem sido demonstrado que têm resolução espacial e temporal excelente para a entrega destes reagentes ^07/02. A resolução temporal deste método é importante porque permite a incorporação desses reagentes em estágios específicos do desenvolvimento. Além disso, como expressão de vetores electroporated ocorre dentro de 6 horas, ^7, este método é mais oportuna do que as abordagens transgênicas. Embora a resolução espacial pode ser extremamente preciso ao alvejar uma única célula ^{2, 6,} muitas vezes é preferível incorporar os reagentes em uma população de células específicas dentro de um tecido ou estrutura. Ao alvejar células múltiplas, em eletroporação in vivo é eficiente para a entrega a uma região específica do embrião, no entanto, particularmente no desenvolvimento do sistema nervoso, é difícil para alvejar tipos específicos de células unicamente através de eletroporação espacialmente discreta. Alternativamente, as linhas de enhancer trap transgênicos oferecem excelentes célula expressão tipo específico de transgenes ^8. Aqui nós descrevemos uma abordagem que combina transgênicos Gal4 baseado linhas armadilha enhancer ⁸ com espacialmente discreta eletroporação in vivo ^{7, 9 e} atingem especificamente a desenvolver neurônios do bulbo olfatório zebrafish. O Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 (anteriormente GA80_9) enhancer trap line descrito anteriormente ^8, exibe alvo expressão transgênica de mCherry mediada por um peixe-zebra otimizado Gal4 (KalTA4) ativador transcricional em várias regiões do cérebro em desenvolvimento, incluindo rombencéfalo, cerebelo, cérebro anterior, eo bulbo olfativo. Para direcionar a expressão GFP especificamente para o bulbo olfativo, um plasmídeo com a seqüência de codificação de GFP sob o controle de múltiplos sítios de ligação Gal4 (UAS) foi electroporated na extremidade anterior do prosencéfalo na hora 24-28 pós-fertilização (hpf). Embora este método incorpora DNA plasmídeo em várias regiões do cérebro anterior, a expressão GFP é apenas induzida em células transgenicamente expressando o fator de transcrição KalTA4. Assim, usando a linha de GA080_9 transgênicos, essa abordagem levou a expressão GFP exclusivamente no bulbo olfativo desenvolvimento. Células expressando GFP alvo através desta abordagem mostraram projeções típicas axonal, como descrito anteriormente para as células mitral do bulbo olfatório ^10. Este método também poderia ser usado para entrega alvo de reagentes, incluindo-hairpin RNA curto plasmídeos expressão interferências, o que daria um método para espacialmente e temporalmente discreta análise de perda de função.

Protocolo

1. Embriões transgênicos

1. Aqui estamos usando uma linha de zebrafish transgênicos criados através de um método de armadilha transposon mediada potenciador ^8. A inserção de transgênicos inclui duas seqüências de codificação: KalTA4, uma versão otimizada zebrafish do ativador transcricional Gal4, ea proteína fluorescente vermelha, mCherry. O enhancer trap método produz linhas de zebrafish transgênicos que expressam esta cassete transgênicos sob controle de uma seqüência enhancer endógena. Assim, dependendo da identidade da seqüência enhancer específicos, expressão de ambos KalTA4 mCherry e está localizada em regiões específicas do cérebro em desenvolvimento. Para o Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 linha que estamos usando aqui, a expressão foi traduzida para vários sites na rombencéfalo, prosencéfalo, e, de particular importância aqui, o bulbo olfativo ⁸ (ver também Fig. 1). . Dado este padrão de expressão, ea localização da cassete dentro do genoma, os transgenes estão previstos para estar sob controle do promotor zic4 ⁸ (ver também http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimagem / lines_distel / main .).
2. Adulto Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 peixes heterozigotos para a inserção transgênicos são tipicamente acasalado com WT peixe (AB), levando a cerca de 50% de descendentes transgênicos. (Para uma maior porcentagem de transgênicos filhotes, dois heterozigotos pode ser acoplado.)
3. A fim de bloquear a formação de pigmento e facilitar imagem fluorescente, tratar os embriões transgênicos com 100 início mM N-phenylthiourea (PTU) em 08/06 hpf.

2. Embriões de montagem

1. No hpf 24-28, transferência de embriões para a água ovo sem PTU. Identificar embriões transgênicos pela expressão de mCherry usando um microscópio de fluorescência. Remover a membrana coriônica de embriões transgênicos usando uma pinça fina. Transferência de embriões livres de suas córion a uma placa de Petri contendo tampão de eletroporação mais 0,02% tricaina [Buffer de Eletroporação: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl _2, 5 mM HEPES, pH 7.2] ^4. 2 minutos para permitir que o anestésico para entrar em vigor antes de prosseguir para a etapa de montagem.
2. Preparar uma solução 0,5% de baixo ponto de fusão ponto de agarose em tampão de eletroporação mais tricaina por microondas a solução, e depois colocar a solução em um 34-37 ° C incubadora. Quando a temperatura da solução de agarose foi equilibrada, coloque uma grande queda (~ 500 mL) da solução de agarose para o centro de uma placa de Petri 60 mm. Adicionar 6-8 embriões anestesiados para esta gota de agarose.
3. Utilizando uma pinça fina (ou as pontas finas das pontas de pipeta corte microloader) posição, os embriões de tal forma que todos eles estão enfrentando na mesma direção e alinhados em uma fileira vertical. Para solidificar a agarose, e prender os embriões em posição, coloque o prato sobre uma placa de Petri grande com 2-3 mm de gelo.
4. Uma vez que a agarose solidificou, inundar o prato com eletroporação tampão mais tricaina, garantindo que a solução cobre completamente a gota solidificada agarose.

3. Micro-injecção de DNA plasmídeo de expressão

1. Prepare a expressão GFP plasmídeo usando um kit de isolamento midi ou maxi-prep plasmídeo (por exemplo, Qiagen). Suspender o plasmídeo para uma concentração final de 0,5 mg / mL em água estéril, mais 0,03% de vermelho de fenol. Para o experimento bulbo olfatório segmentação descrita aqui, estamos usando uma expressão plasmídeo com a seqüência de codificação de EGFP sob o controle de múltiplos sítios de ligação Gal4 (14 seqüências em tandem UAS eo promotor de peixe basal, E1b). Usando este plasmídeo, apenas as células transgenicamente expressando o fator de transcrição KalTA4 será capaz de expressar a GFP, assim, alvo de mediação expressão GFP.
   Nota: aqui nós estamos usando vermelho de fenol para a visualização de injeções de DNA, que deve ser aplicado para o direcionamento de outras regiões do cérebro em desenvolvimento, desde que a região pode ser acessado a partir dos ventrículos. Para o direcionamento de outros tipos celulares que requerem visualização fluorescentes, Bodipy ou corantes Quantam Dot poderia ser usado para visualizar injeções sob iluminação fluorescente.
2. Pipetas de microinjeção pode ser fabricado usando um extrator pipeta horizontal ou vertical. Definições de calor e puxe-força irá variar dependendo do tipo de extrator, o tipo de elemento de aquecimento, e do tipo de tubos capilares de vidro.
   Usando um P-30 Sutter puxador vertical, use uma configuração de calor de 980 e um pull-força de 960 para produzir longas, afiladas, pipetas acentuada a partir de paredes finas de vidro de borosilicato capilar com filamentos [Instrumento Sutter # BF100-78-10]. Pipetas Microinjetion puxado com essas configurações são selados e deve ser quebrado de volta antes da injeção.
3. Use uma ponteira microloader para adicionar 1-2 mL de solução de DNA plasmidial para a pipeta de injeção.
4. Montar esegura a pipeta carregado na pressão titular pipeta de injeção do sistema.
5. Ruptura de volta a pipeta carregado com uma pinça bem até produzir pulsos de pressão liberação inchado da solução de DNA vermelho. Em alternativa, dicas podem ser quebrados por volta rapidamente a penetração de uma submersa, dobrado Kimwipe laboratório.
   Nota: porque as pipetas de injeção são inicialmente fechado e deve ser manualmente quebrado de volta, o tamanho da ponta e do volume de injeção são variáveis. Pipetas de injeção ideal deve exigir 3-5 pulsos de injeção para encher completamente o ventrículo prosencéfalo desenvolvimento de 24 embriões hpf (100 pulsos de injeção ms a 40 psi).
6. Injetar a solução de DNA plasmidial para os ventrículos do cérebro em desenvolvimento como DNA que é forçado ao lado, e intercaladas em, a região do cérebro destinada a formar o bulbo olfativo. O bulbo olfativo é derivado de células da parede mais anterior do ventrículo do cérebro anterior. Assim, ao inserir a pipeta de injeção nos ventrículos de tal forma que a pipeta está apontando em direção à extremidade anterior do cérebro em desenvolvimento, a injeção de pressão força o DNA em e adjacente ao bulbo olfativo prospectivos. Injetar DNA até que a tintura vermelha é claramente visível na extremidade anterior do ventrículo do cérebro anterior. Porque o DNA começa a se difundir imediatamente, diluir o DNA, é importante avançar para a etapa eletroporação o mais rapidamente possível após a injeção (por exemplo, dentro de 10 seg).

4. Eletroporação

1. Eletroporação é realizada utilizando eletrodos de auto-construção feita com eletrodos de platina Grama subdérmico (Tecnologia Grama # E2). Os eletrodos são conectados a um sonda de mão, ea distância final entre os eletrodos de platina deve ser de 1 mm (para mais detalhes sobre a construção ver ^9). Pulsos de onda quadrada eletroporação são produzidos, ligando os eletrodos para um SD-9 Grama Stimulator (Grass Technology, modelo SD-9).
2. Definir o estimulador SD-9 para produzir único, 5 pulsos eletroporação ms a 70 volts. Posição dos eletrodos de tal forma que o eletrodo positivo é posicionado adjacente à extremidade anterior do embrião, enquanto o eletrodo negativo é posterior à cabeça do embrião. Iniciar manualmente ~ 7-8 pulsos eletroporação usando o interruptor de modo único do SD-9 estimulador, separando cada pulso por ~ 1 seg. Tensões apropriado irá variar dependendo da idade dos embriões ea fonte de tensão utilizada. Embriões mais jovens requerem tensões mais baixas para evitar danos embrião, que os embriões mais velhos necessitam de altas tensões para iniciar eletroporação ^7.
3. Permitir que os embriões para recuperar pelo menos 10 minutos após a eletroporação antes de libertá-los da agarose.
4. Utilizando uma pinça fina, livre de embriões a partir do rastreamento agarose suavemente o contorno dos embriões, evitando contato real com os próprios embriões.
5. Uma vez libertado, o retorno dos embriões à água de ovo (com PTU se necessário). Mantê-los a 28 ° C até que estejam a ser trabalhada para a expressão GFP.

5. Embriões de montagem para imagens

1. Transferência de embriões a partir de água do ovo mais PTU à água do ovo mais 0,02% tricaina. Permitir que alguns minutos para o anestésico para entrar em vigor antes de prosseguir para a etapa de montagem.
2. Preparar uma solução 0,5% de baixo ponto de fusão agarose no ovo água mais tricaina por microondas a solução, e depois colocar a solução em um 34-37 ° C incubadora. Quando a temperatura da solução de agarose foi equilibrada, coloque uma grande queda (~ 300 mL) da solução de agarose para o centro de uma placa de Petri 35 mm. Adicionar um embrião anestesiados para esta gota de agarose.
3. Utilizando uma pinça fina (ou as pontas finas das pontas de pipeta corte microloader) posição, a tais embriões que estão na posição vertical, tornando possível a visualização de uma vista dorsal do cérebro em desenvolvimento com um microscópio vertical (escopos invertida exigirá uma geometria embrião diferente, e um prato diferente permitindo a visualização a partir de baixo, ver ^12). Solidificar a agarose, colocando o prato sobre uma placa de Petri grande com 2-3 mm de gelo. Re-orientação com uma pinça fina provavelmente será necessária durante a solidificação para garantir que o embrião não cair para o lado.
4. Uma vez que a agarose solidificou, inundar o prato com ovos água mais tricaina garantindo que a solução cobre completamente a gota solidificada agarose.

6. Resultados representativos:

Embora a expressão GFP pode ser observado tão cedo quanto seis horas após a eletroporação, aqui estamos mostrando imagens de um embrião 4 dias após o eletroporação de tal forma que a estrutura de neurite das células-alvo está suficientemente desenvolvido. O Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgênicos linha de armadilha enhancer exibe expressão constitutiva de mCherry (e KalTA4) na parte posterior do cérebro, cerebelo, cérebro anterior, e bulbo olfatório em embriões de cinco dias pós-fertilização (Fig. 1A e 1C). Embriões que têm tido uma expressão UAS-GFP plasmídeo incorporados por eletroporação alvo (como descrito acima), mostram expressão GFP, que é restrita a células do bulbo olfativo de desenvolvimento (Fig. 1B, 1D e 1E). Apenas as células que expressam transgenicamente o fator de transcrição KalTA4 são capazes de ativar a expressão deste plasmídeo UAS-GFP. Incorporação desse plasmídeo em embriões não-transgênicas não leva a qualquer expressão GFP detectável. Assim, é a ação combinada de eletroporação alvo de UAS-GFP e de expressão transgênica localizada do motorista KalTA4 que leva à expressão exclusiva de GFP em células do bulbo olfativo desenvolvimento. A GFP células que expressam show típico projeções axonal das células bulbo olfatório mitral (Figura 1B e 1D) ^10. Para visualizar projeções axônio, imagens em figura 1B e 1D teve que ser exposto a altos níveis tais que a região de corpos celulares foram bem mais exposto. A menor nível de exposição (Fig. 1E) mostra que os corpos celulares expressando GFP são de fato localizada no bulbo olfatório (compare Fig. 1C e 1E;. Linha cinza marca a fronteira do bulbo olfatório).

Figura 1. Targeted expressão GFP no bulbo olfativo de um embrião de peixe-zebra 5 dpf. O Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgênicos linha de armadilha enhancer, exibe expressão constitutiva de mCherry no rombencéfalo cerebelo, cérebro anterior, e bulbo olfatório (A e C, mCherry fluorescência mostrada em vermelho). Essa expressão de mCherry é mediada por transgênicos Gal4-expressão. Embriões que foram electroporated com um vetor de expressão UAS-GFP aos 28 hpf, display expressão GFP-alvo do bulbo olfatório até 5 dias pós-fertilização (B, D e E, de fluorescência da GFP mostrado em verde. Embrião mesmo que em A e C). Uma imagem de menor exposição, no fundo, (E) mostra que a expressão GFP é limitado a organismos de células do bulbo olfativo. A linha cinza indica a borda do bulbo olfatório. Campo claro (escala de cinza), fluorescência verde (verde), e fluorescência vermelha (red) todas as imagens foram ter com um microscópio Olympus BX60 fluorescência.

Discussão

Aqui nós descrevemos um método de eletroporação in vivo em zebrafish que utiliza um enhancer trap Gal4 linhagem transgênica para direcionar a expressão do transgene electroporated a uma população específica de células no bulbo olfativo desenvolvimento. Esta abordagem combina a excelente resolução temporal de eletroporação in vivo ⁷ com a expressão tipo específico de células mediado por linhas de enhancer trap transgênicos ^8. Embora aqui temos descrito o direcionamento do bulbo olfatório, em eletroporação in vivo podem ser usados ​​para atingir outras regiões do sistema nervoso em desenvolvimento ^2-7, e linhas de enhancer trap estão disponíveis com a expressão específica de Gal4 em muitos diferentes tipos de células ou tecidos específicos ^{8, 11.} É claro, esta técnica de eletroporação também deve ser adequado para outros combinatioral abordagens genéticas, como a LexA ou sistemas de Tet ^{13, 14, 15.} Uma grande vantagem da eletroporação é que não há necessidade de fazer mais linhagens transgênicas, uma vez que uma adequada Gal4-line está disponível. Isso economiza seis meses.

Na eletroporação in vivo permite a incorporação de oligonucleotídeos em neurônios e seus precursores em qualquer estágio específico de desenvolvimento de sistemas nervoso é de interesse ^7. Esta resolução temporal é particularmente vantajoso para a perda de função de análise, porque pode contornar problemas com genes alvo que têm funções essenciais em estágios precoces do desenvolvimento. O método descrito aqui também pode ser usado para incorporar a perda de função, incluindo reagentes oligonucleotides RNAi ou construções e anti-senso morfolino oligonucleotides ^{4, 7.} Plasmídeo-driven reagentes, tais como dominante negativo plasmídeos proteína expressão ou plasmídeos hairpin curto-RNAi também pode ser colocado sob controle de um Gal4 UAS, permitindo que para o tipo específico de célula precisa a expressão que temos mostrado aqui para expressão da GFP.

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