É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Method Article
Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.
Estímulos visuais são detectados e transmitidos em uma ampla faixa dinâmica de intensidades de luz e mudanças de freqüência por neurônios especializados na retina de vertebrados. Duas classes de neurônios da retina, fotorreceptores e células bipolares, fazer isso usando a fita do tipo zonas ativas, que permitem a liberação do neurotransmissor sustentada e de alto rendimento em períodos de tempo longos. ON tipo misto de células bipolares (Mb) terminais na retina peixinho, que despolarizar a estímulos de luz e receber vara mista e cone de entrada de fotorreceptores, são adequados para o estudo da fita do tipo sinapses tanto devido a seu grande tamanho (~ 12/10 diâmetro mm) e aos seus inúmeros lateral e recíprocas conexões sinápticas com dendritos de células amácrinas. Acesso direto aos terminais Mb de células bipolares da retina em fatias goldfish com a técnica de patch-clamp permite a medição de Ca 2 + pré-sináptico correntes, alterações de capacitância de membrana, e inibição de feedback recíproco sináptica mediada pelo GABA <receptores sub> A e GABA C expresso nos terminais. Medições membrana pré-sináptica capacitância de exocitose permitem estudar a plasticidade de curto prazo da liberação do neurotransmissor excitatório 14,15. Além disso, a plasticidade de curto prazo e longo prazo da liberação do neurotransmissor inibitório das células amácrinas também pode ser investigado por gravações de inibição de feedback recíproco de chegar ao terminal Mb 21. Em períodos curtos de tempo (por exemplo, ~ 10 s), a inibição GABAérgica comentários recíproca a partir de células amácrinas sofre pares de pulso, depressão através de esgotamento GABA vesícula piscina 11. A dinâmica de microcircuitos sináptica da retina na camada plexiforme interna da retina podem, portanto, ser diretamente estudados.
A técnica do cérebro fatia foi introduzida mais de 40 anos atrás, mas ainda é muito útil para a investigação das propriedades elétricas dos neurônios, tanto na soma única célula, dendrite única ou axônio, e microcircuit nível sináptico 19. Tecidos que são pequenos demais para ser colado diretamente na câmara de corte são muitas vezes incorporadas no primeiro agar (ou colocado em um filtro de papel) e depois em fatias 20, 23, 18, 9. Neste vídeo, nós empregamos a técnica de agar pré-incorporação usando retina goldfish. Alguns dos gigantes terminais célula bipolar em nossa retina fatias de peixe dourado são axotomized (axônio corte) durante o processo de corte. Isso nos permite isolar única entradas terminal pré-sináptico do nervo, porque a gravação dos terminais axotomized exclui os sinais do compartimento soma dendríticas. Alternativamente, pode-se também gravar a partir de células intactas Mb bipolar, por gravação a partir de terminais ligados ao axônios que não foram cortadas durante o processo de corte. No geral, a utilização deste protocolo experimental ajudará nos estudos da fisiologia sináptica da retina, análise de microcircuito funcional, ea transmissão sináptica em sinapses fita.
1. Soluções externas e internas
2. Patch-clamp eletrodos pipeta
3. Preparação de agar-embedded fatias da retina
Resolução de Problemas:
Se a parte da retina embutido no bloco de agar é separada ou sai do ágar durante a corte, pode-se aumentar a espessura de corte de 200 mM de até 300 mm, em incrementos de 20 mM. Também tentar minimizar a quantidade de solução em torno da retina, uma vez que é transferido e colocado no ágar líquido por sugando solução extra com um "Kimwipe" rolou ponta de papel. Outra forma de evitar este problema é reduzir o tamanho do pedaço de retina inicialmente colocados no agar. Porque humor vítreo proíbe agar de totalmente anexando à peça da retina, pode ser necessário fazer hialuronidase frescos ou ajustar o tempo de incubação (etapa (3.3)).
4. Identificação do terminal de célula bipolar sináptica em uma fatia da retina
5. Gravações eletrofisiológicas e Ca 2 + imagem
Resolução de Problemas:
Se uma freqüência não consegue estabelecer uma configuração de célula inteira, mesmo após a formação de um selo GÊ estável, pode ser útil para reduzir a pressão negativa, utilizado para perfurar o terminal membrane. Também pode ser o caso que a pressão de sucção ideal para a criação de células inteiras configuração varia em função da curvatura da membrana (soma> terminal). Também é possível usar um protocolo de zap (Amplitude: 400 mV, Duração: 100 mS) para entrar na configuração de célula inteira, sozinho ou em combinação com um pulso acentuada de pressão negativa. Nós encontramos o protocolo zap ser particularmente útil para break-in quando se utiliza uma ponteira com uma resistência de banho em excesso de 12 mohms.
6. Resultados representante
Figura 1. Identificação de terminais Mb célula bipolar em fatias goldfish da retina. (Ac) IR-DIC imagens de terminais celulares Mb bipolar. Podemos identificar terminais provável axotomized (axônio-cut) e intacto na imagem IR-DIC. Um terminal axotomized aparece redondo e circular, como mostrado na cenquanto um terminal intacta é mais provável que apareça elíptico, como mostrado em um e b. Esta classificação pode ser confirmada por medição de capacitância transitórias (ver Figura 2) ou pelo método de tintura de enchimento (d - f). Setas vermelhas indicada a localização da interseção entre o axônio eo terminal do axônio para os terminais intacto em a e b. Linha pontilhada vermelha indica o contorno de terminais celulares Mb bipolar. (Df). Imagens de fluorescência de terminais Mb célula bipolar com um axônio intacta (d), um axônio parcialmente cortadas (e), ou um axônio totalmente removidos (f). Alexa 555 (A20501MP, Invitrogen) corante fluorescente foi preenchido com solução interna antes da gravação. Imediatamente depois de patch-clamp de gravação, a fatia da retina foi transferido para 4% (wt / vol) paraformaldeído (P6148, Sigma) em solução tampão fosfato (70013, GIBCO) e incubado por 30min. Cortes foram montados em lâminas Superfrost (Fisher Scientific) em meio de montagem aquoso com anti-fading agentes (Biomeda corp). Alexa contendo 555 Mb terminais de células bipolares eram vistos com uma linha de laser 555 nm (vermelho) utilizando objetiva de imersão em água-40x em um microscópio confocal de varredura a laser (LSM 710, Carl Zeiss). Observe a presença de pequenos apêndices telodendria salientes dos terminais do axônio (setas azuis). Barra de escala indicam 10 mM (a - f). INL: camada nuclear interna, IPL: camada plexiforme interna, GCL: camada de células ganglionares.
Figura 2. Propriedades elétricas de axotomized e intacto Mb terminais célula bipolar. (A, c) A resposta transitória atual ativado por um degrau de tensão hiperpolarização-clamp do potencial de realização de -60 mV a -70 mV. A resposta curta atual para um degrau de tensão -10 mV-clamppode resultar em: 1) um único decaimento exponencial rápida corrente com resistência de entrada elevada a -70 mV (indicativo de um terminal axotomized; painel a), ou 2) um decaimento exponencial duplo com resistência de entrada baixa a -70 mV (indicativo de um terminal intactos; painel c, ver também 12, 14, 15). (B, d) Ca 2 + correntes e saltos capacitância de membrana foram evocados por uma despolarização passo de -70 a 0 mV. Tempo resolvido medições de capacitância de membrana usam um estímulo de 2 kHz sinewave sobreposta sobre o potencial de repouso segurando -70 mV 6. O traço vermelho é o valor médio dos dados dos pontos de capacitância. Note-se que o salto de capacitância na Figura 2b e 2d são ambos iguais a cerca de 200 fF.
Figura 3. Medidas diretas de Ca 2 + sinais de imagem, exocitose, e feedback inibitório em um Mb terminal de célula bipolar. (A) Um aumento transitório da concentração de Ca 2 + no telodendria de um terminal Mb foi ativada por um degrau de tensão despolarização-clamp de -70 a 0 mV para 200 ms (seta). Oregon Verde 488 BAPTA-1 (100 M), um indicador de Ca 2 + corante, foi incluído na pipeta patch. (B) imagem correspondente fluorescência do telodendria Mb (região de interesse indicada pela linha pontilhada vermelha). (C) a depressão de curto prazo sináptica da liberação de neurotransmissores (exocitose). Ca 2 + correntes (traço médio) e membrana de capacitância (traço inferior) evocada por um par de 20 despolarizações ms a 0 mV (traço superior; 200 ms intervalo inter-pulso). A seta indica o efeito de prótons exocytosed sobre o Ca 2 + atual e também a inibição GABAérgica comentários recíprocos da vizinha células amácrinas 15, 21. Note-se que a inibição de prótons mediado do Ca 2 + atual e também a GABInibição do feedback Aergic recíprocas estão presentes apenas na primeira resposta despolarizante, que também tem um salto de capacitância devido à exocitose de vesículas sinápticas.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Um passo crítico e difícil em nosso protocolo é a transferência do pedaço de retina na solução de agar (protocolo 3.4). É necessário remover cuidadosamente o humor vítreo e solução fatia residual do pedaço da retina e transferi-lo sem distorção ou flexão. A fim de conseguir isso, usamos uma pequena espátula (21-401-25B, Fisherbrand) com uma ponta dobrada para formar um ângulo de 90 °, juntamente com uma pinça ponta angulada (11251-35, Ferramentas Ciência Fine), para posicionar a ret...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Nós não temos interesses concorrentes a divulgar.
Agradecemos ao Dr. Fred Rieke para o seu tipo de explicação o ágar-embedded preparação fatia da retina quando começamos a usar o protocolo em nosso laboratório. Agradecemos também a Lori Vaskalis para a ilustração do esquema visão geral e as Dras. Veeramuthu Balakrishnan e Soyoun Cho para comentários úteis no texto e vídeo. Este trabalho foi financiado por um NEI-NIH RO1 concessão, e também foi parcialmente financiado por uma Research Foundation Grant Coréia financiado pelo Governo coreano [KRF-2008-357-E00032].
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
Agar gelificação baixa temperatura | Sigma | A0701 | Agarose tipo VII-A |
Pipeta de patch | Precision Instruments mundo | 1B150F-4 | De paredes espessas (1,5 mm de diâmetro externo) de vidro borosilicato |
Extrator Vertical | Narishige | PP830 | |
Cera dental | Cavex | ||
Tesoura primavera | Multa Ferramentas Ciência | 15003-08 | |
45 ° angulada pinça de ponta fina | Multa Ferramentas Ciência | 11251-35 | |
Gilete | Personna | De dois gumes, limpa com álcool 70% e H 2 O | |
Tubo cilíndrico | Fisherbrand | 03-338-1B | Polietileno frascos de amostra 2,5 ml |
Hialuronidase | Sigma | H6254 | |
Vibratome slicer | Leica | VT1000S ou VT1200S | |
Microscópio vertical | Olimpo | BX51WI | |
Objetiva de imersão em água-60x | Olimpo | LUMPlanFl | NA 0,90 |
CCD da câmera | Sony | XC-75 | |
Camera controlador | Hamamatsu | C2400 | |
Monitorar | Sony | 13 monitor "preto e branco | |
Seringa filtro | Nalgene | 0,2 m | |
Micromanipulador | Instrumento Sutter | MPC-200 | |
Amplificador lock-in | Heka | EPC-9/10 amplificadores têm emulação de software | |
Microscópio confocal a laser girando disco | Yokogawa | CSU-X1 | Imagens de células vivas após patch-clamp gravação de células inteiras |
Slidebook software | Inteligente de imagem Instruments (3i) | Imagem de aquisição de dados e análise | |
Paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
Solução tampão fosfato | GIBCO | 70013 | |
Slides Superfrost | Fisher Scientific | Slides de vidro | |
Anti-fading agentes | Biomeda corp. | ||
Microscópio confocal de varredura a laser | Carl Zeiss | LSM 710 | De imagem de tecido fixado |
Espátula | Fisherbrand | 21-401-25B | |
Manuel verticais slicer | Narishige | ST-20 | |
Oregon Verde 488 BAPTA-1 | Invitrogen | O-6806 | Ca 2 + corante fluorescente sensível |
Alexa Fluor 555 Hydrazide | Invitrogen | A 20501MP- | Corante fluorescente |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados