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Dois métodos distintos para as fábricas de tela com nematóides de galha-são descritos. As abordagens descritas incluem alto rendimento telas com nemátodos de uma maneira não destrutiva para facilitar a utilização destas plantas em programas de criação.
Galhas-nematóides (gênero Meloidogyne) são parasitas de plantas obrigatórios. Eles são extremamente polífagas e considerado um dos fitonematóides economicamente mais importantes parasitas. O microscópico segundo estágio juvenil (J2), molted uma vez no ovo, é o estágio infectante. Os J2s eclodem dos ovos, mover-se livremente no solo dentro de uma película de água, e localizar pontas de raízes das espécies de plantas adequadas. Após penetrar a raiz da planta, eles migram em direção ao cilindro vascular onde estabelecer um local de alimentação e iniciar a alimentação de seus estiletes. O local de alimentação multicelular é composto por vários ampliadas células multinucleadas chamados 'células gigantes' que são formados a partir de células que foram submetidos a karyokinesis (repetido mitose) sem citocinese. Periciclo células vizinhas dividir e ampliar em tamanho dando origem a uma vesícula típica ou nó raiz, o sintoma característico da raiz nó-infecção por nematóides. Uma vez que a alimentação é iniciada, tornar-se sedentário e J2s undergo três mudas adicionais para se tornarem adultos. A fêmea adulta estabelece 150-250 ovos em uma matriz gelatinosa em ou abaixo da superfície da raiz. A partir dos ovos eclodem J2s infecciosos novos e iniciar um novo ciclo. A raiz-nó ciclo de vida do nematóide é completado em 4-6 semanas a 26-28 ° C.
Aqui nós apresentamos o protocolo tradicional de infectar plantas, cultivadas em vasos, com galhas-nematóides e dois métodos de ensaios de alto rendimento. O método de alto rendimento primeira é usada para plantas com sementes pequenas, como tomate, enquanto o segundo é para as plantas com sementes grandes, como feijão caupi e comum. Sementes grandes apoiar o crescimento das mudas estendida com suplemento nutricional mínimo. O ensaio de taxa de transferência de alta primeiro utiliza plântulas crescidas em areia em bandejas, enquanto nas plantas segundo ensaio são cultivadas em bolsas, na ausência de solo. A bolsa de crescimento de plântulas é feita de um pavio 15,5 x 12,5 centímetros de papel, dobrada na parte superior para formar uma calha 2-centímetros de profundidade na qual as sementes ou plântulas é colocado. Opavio de papel está contido dentro de uma bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crescimento permitir a observação directa dos sintomas de infecção, de nematóides das raízes galhadores e produção em massa de ovo, sob a superfície de uma bolsa transparente. Ambos os métodos permitem a utilização das plantas rastreados, após fenotipagem, para a passagem ou de produção de sementes. Uma vantagem adicional da utilização de bolsas de crescimento é o requisito de espaço pequeno, porque são armazenados em bolsas de plástico pastas penduradas dispostos em prateleiras.
1. Crescimento de mudas de tomateiro em vasos e bandejas
2. Cowpea Crescimento em bolsas de plântulas
3. Extração de ovos de nematóides
Extração de eGGS de raízes infectadas é modificado a partir de um protocolo desenvolvido por Hussey e Barker (1973).
4. Nematóides de ovos para incubação
5. Infecção tomate Root em vasos ou bandejas e avaliação de infecção
6. Cowpea Infecção Root em Bolsas e avaliação de infecção
7. Os resultados representativos
As fases adequadas do tomate e caupi plantas para as inoculações de nematóides, para os dois sistemas descritos são mostrados nas Figuras1 e 2. Além disso, exemplos de bem-infectadas raízes de tomate e caupi são mostrados nas Figuras 4 e 5. Tal como na maioria das telas de resistência à doença, é aconselhável a utilização de pelo menos 6-10 plantas por genótipo para a inoculação de nemátodos para calcular a média da taxa de infecção. Variação da infecção por nematóides entre as plantas, do mesmo genótipo, pode ser reduzido pelo uso de tamanho uniforme e planta quantidade exacta e entrega de inoculo.
A utilização de tabuleiros e bolsas de crescimento permite rastreio de centenas a milhares de plantas em um espaço pequeno crescimento. Bolsas de crescimento também permitem rápido e eficiente de avaliação não destrutiva de infecções galhas-nematóides sem a necessidade de raízes de lavagem (Figura 4).
Figura 1. A duas semanas de idade, planta caupi cultivado em uma bolsa e pronto para o root-knot nemaTode inoculação.
Figura 2. A três plantas de tomate semanas de idade, pronto para galhas-inoculação do nematóide.
Figura 3. Uma agulha modificado e utilizado para ponta de pipeta de alto rendimento inoculação de nematóides. A parte inferior de uma agulha foi selado e três conjuntos de furos foram perfurados na agulha usando um feixe de laser. Em seguida, a agulha modificado foi colada a uma ponta de pipeta de 5 ml.
Figura 4. Um sistema radicular de tomateiro com galhas-nematóides.
Figura 5. Um sistema radicular caupi com massas de ovos corados com erioglaucine 30 dias pós-inoculação crescido a28 ° C.
Há dois passos essenciais para uma tela de nematóide de sucesso: preparação de um inóculo altamente infecciosa e uso de plantas na fase adequada de desenvolvimento. Taxa de eclosão de ovos de nematóides de galha-é altamente variável e varia entre 5 - 50%. Portanto, para obter níveis ótimos de escotilha e J2s altamente infecciosa, atenção deve ser dada para a extração de ovos para incubação e procedimentos. Ovos deve ser exposto a lixívia por um período mínimo de tempo e de lixívia deve ser lavado para fora a partir da mistura bem de raiz. Quando a eclosão dos ovos, a lama contendo os ovos não deve ser mergulhado em água. Além disso, evitar derramar os ovos em uma placa de Petri subjacente, onde os jovens nascidos são coletados. Uma maneira de evitar o derramamento dos ovos durante o processo de incubação não é adicionar água diretamente ao Kimwipe como o papel pode quebrar. Em vez adicionar a água directamente para a placa de Petri.
Para melhores resultados, use J2s recém-nascidos. Se o hatctaxa h é baixa e mais inoculo é necessário, J2s pode ser armazenado a 15 ° C durante um período mais longo. Aquecer o inoculo armazenado à temperatura ambiente para recuperar os nematóides antes da inoculação. No entanto, não armazenam os J2s durante períodos prolongados, mesmo a 15 ° C como J2s starved não irá infectar de forma eficiente.
Mudas jovens são o melhor estágio de desenvolvimento de galhas-inoculação do nematóide. No entanto, este tem de ser equilibrada com a formação de um sistema de raiz adequada que permita um número suficiente de pontas de raízes como pontos de entrada para os J2s. Manter condição de crescimento ideal das plantas é também crítico para as telas. Evitar o excesso de rega-plantas, especialmente aquelas cultivadas em bolsas. Mais-molhar as bolsas, como indicado por pé de água no fundo da bolsa, pode promover o crescimento de fungos e diminuir a saúde da raiz.
Com ambos os ensaios de avaliação subsequente da infecção de nematóides e cálculo do número de ovos / sistema radicular e ovos / grama de freraiz sh pode ser realizada. Para os ensaios de tomate, raízes individuais são pesados e de ovos extraídos como descrito para a preparação de inóculo (secção 3). Quando o processamento grande número de amostras de plantas, sistemas de raízes individuais poderiam ser macerada usando um misturador para a extracção de ovo. O número de ovos devem ser contadas em pelo menos três alíquotas e os ovos / grama de sistema de raízes frescas calculado. Para os ensaios de bolsa, o sistema da raiz é puxado para fora do inserto de papel, pesados, e os ovos extraído.
Não temos nada a divulgar.
Pesquisa em Kaloshian laboratório é financiado por uma concessão dos Estados Unidos Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (2007-35607-17765). Pesquisas em laboratório Roberts é financiado por doações da Agência dos Estados Unidos para Desenvolvimento Internacional (GDG-G-00-02-00012-00 e EDH-A-00-07-00005) e da Califórnia feijão Conselho Consultivo.
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