Alterações de perfil em Receptor Fosforilação da tirosina quinase utilizando matrizes de anticorpos - Publicidade

Resumo

Matrizes de anticorpos proteoma Profiler são uma forma conveniente e eficiente para a tela para mudanças no receptor tirosina quinase (RTK) fosforilação sem a realização de numerosos imunoprecipitação (IP) Westerns. A matriz RTK ARY001 Human permite a medição qualitativa das RTK múltiplos numa única amostra usando detecção por quimioluminescência.

Resumo

A desregulação da expressão de receptores de tirosina-quinase (RTK) e fosforilação está frequentemente associada com a propagação e o desenvolvimento metastático de células cancerosas. Esforço significativo ^1-3 tem sido focada em desenvolver inibidores específicos para alvejar RTKs e interromper as vias de sinalização aberrantes associados com estados de doença . ^4-7 O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de um seleto número de inibidores de fosforilação de TKU. Este estudo utilizou a matriz Phospho-RTK humanos, que é uma membrana de imunoensaio em sanduíche com base para monitorar aumentos ou diminuições na fosforilação de RTKs numerosas simultaneamente numa única amostra. Neste ensaio, as duas RTKs fosforiladas e não fosforilada presente em uma amostra de lisado são capturados por anticorpos discretos impressos em duplicado através de uma membrana de nitrocelulose, o tamanho de uma lâmina de microscópio. Após lavagem, as matrizes são incubadas com anti-fosfo-tirosina-peroxidase de rábano (HRP),que sanduíches com TKUs fosforilados capturados na matriz. Após um passo de lavagem em segundo lugar, as matrizes são incubados com reagentes quimioluminescentes. Sinal gerado em cada ponto da matriz é proporcional à quantidade de proteína fosfo-ligado por cada anticorpo de captura. Nestas experiências, as matrizes foram utilizadas para medir o aumento de fosforilação após a estimulação do ligando ou do cancro da mama MDA-MB-453 ou III KATO células de carcinoma gástrico, bem como para caracterizar diminuições na fosforilação associados com o tratamento de células com inibidores selectivos para ErbB ou família FGF membros R.

Protocolo

1. Preparação da Amostra

1. Colete de lisados ​​não tratada, ligando tratada, inibidor ou ligante e células tratados seguindo as orientações na folha de dados matriz humana Phospho RTK. O tampão de lise foi otimizado para este kit. A substituição dos tampões de lise podem afectar o desempenho final da matriz. Para evitar a degradação proteolítica da amostra, adicionar 10 ug / ml de aprotinina, 10 ug / ml de leupeptina, pepstatina e 10 ug / ml de A para o volume de tampão de lise requerido para cada preparação de lisado de células fresca para cada utilização.
2. Lysate concentração deve ser medido utilizando um ácido bicinconínico (BCA) de ensaio. Concentração da amostra pode ser empiricamente ajustada para uma sensibilidade óptima e de fundo baixo. Uma gama de 100-300 ng de lisado é recomendado como um ponto de partida inicial.
3. Congelamento / descongelamento de amostras devem ser evitados e armazenamento adequado de lisados ​​é necessário para o desempenho ideal. Descongelar as amostras congeladas lisado em gelo.

2. Ensaio matriz

1. Trazer todos os componentes do kit para a temperatura ambiente antes do uso. Para evitar contaminação, usar luvas durante a realização dos procedimentos.
2. Pipetar 2,0 ml de tampão de matriz 1 em cada poço do prato de 4 Bem-Multi a ser utilizado. Tampão de matriz 1 serve como um tampão de bloqueio.
3. Usando televisão de ponta pinça, remova cada membrana para ser usado por entre as folhas de protecção e coloque em um poço do 4-Bem prato Multi-. O número da matriz deve estar voltado para cima.
4. Em contacto com uma matriz de tampão, o corante azul das manchas desaparecerá, mas os anticorpos de captura são mantidas nos seus locais específicos.
5. Incubar durante 1 hora numa plataforma de agitação. Oriente a bandeja de modo que cada matriz final rochas para terminar em seu bem. A superfície da matriz deve ser completamente molhada e cobertos por tampão de bloqueio.
6. Enquanto as membranas são bloquear, dilui-se a quantidade desejada de lisado celular para um volume final de 1,5 ml com tampão de matriz 1.
7. Tampão matriz Aspirar um dos poços da placa de 4 Bem-Multi e adicionar soluções diluídas lisado. Colocar a tampa no prato 4-Multi-Well.
8. Incubar durante a noite a 2-8 ° C numa plataforma oscilante. Um tempo de incubação mais curto pode ser utilizado se a sensibilidade óptima não é necessária.
9. Cuidadosamente remover cada membrana a partir da 4-Well prato múltipla e colocar nos recipientes individuais de plástico com 20 ml de tampão de lavagem 1X. O 4-Well prato múltipla não pode ser usada para completar os passos de lavagem. Lavar o 4-Bem-prato Multi com água deionizada ou destilada e seque bem.
10. Lavar cada membrana com 1X tampão de lavagem durante 10 minutos num agitador de plataforma oscilante. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens.
11. Diluir o anti-fosfo-tirosina-peroxidase de rábano tampão de detecção (HRP) em 1X tampão de matriz 2, utilizando o factor de diluição, no rótulo do frasco. Pipetar 2,0 ml de uma solução diluída para cada poço do prato de 4 Multi-Well.
12. Remova cuidadosamente cada membrana de seu recipiente de lavagem.Permitir tampão em excesso para drenar a partir da membrana e voltar a membrana para o 4-Well prato Multi-diluído contendo o anti-fosfo-tirosina-HRP. Cobrir os poços com tampa.
13. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
14. Lavar cada matriz, tal como descrito anteriormente.
15. Conclua as etapas restantes, sem interrupção. Remova cuidadosamente cada membrana de seu recipiente de lavagem. Permitir tampão para drenar o excesso da membrana por blotting da aresta inferior em papel absorvente. Colocar cada membrana em uma folha de plástico protector, com o número de identificação para cima.
16. Pipeta de 1 ml do reagente preparado Chemi Misturar uniformemente para cada membrana. Utilizando menos do que 1 ml de Reagente Mix Chemi por membrana pode resultar na cobertura incompleta da membrana. A substituição de alguns reagentes de alta intensidade quimioluminescentes para Chemi Reagentes 1 e 2 podem causar um fundo aumentado ou diminuído, dependendo do sinal do reagente.
17. Cuidadosamente cubra com um plásticoprotetor da folha. Gentilmente suavizar as bolhas de ar e garantir Chemi Mix Reagente é distribuído uniformemente a todos os cantos de cada membrana. Incubar durante 1 min.
18. Toalhas de papel de posição em cima e dos lados do protetor da folha de plástico contendo as membranas e cuidadosamente esprema o excesso de reagente Mix Chemi.
19. Retire o protetor da folha superior de plástico e cuidadosamente colocar um laboratório absorvente sobre o topo das membranas para apagar de desconto em qualquer misturar reagentes restantes Chemi.
20. Deixando de membranas no protetor inferior da folha de plástico, cobrir as membranas com filme plástico com cuidado para delicadamente eliminar possíveis bolhas de ar. Envolver o envoltório excesso de plástico em torno da parte de trás da folha de protector a fim de que as membranas e protetor folha está completamente enrolada.
21. Coloque as membranas com os números de identificação voltadas para cima, de uma cassete de película auto-radiografia que não é utilizado com detecção de isótopos radioactivos.
22. Expor a película Kodak Luz BioMax para min 1-10. Várias exposições são Recomterminou. Alternativamente, as imagens podem ser coletados por meio de um gerador de imagens de quimiluminescência compatível, como a Carestream Health Imagem Estação 4000mm PRO.

3. Análise de Dados

1. Sinais positivos observados em filme desenvolvido podem ser rapidamente identificados através da colocação da camada de transparência sobre a imagem da matriz e alinhando-a com os pares de pontos de referência impressos nos cantos para esta finalidade. O número de identificação estampado sobre a matriz deve ser colocado no lado esquerdo tinha. A localização dos controles e anticorpos de captura está listada no apêndice da folha de dados matriz humana Phospho RTK.
2. Densidades de pixel em filme desenvolvido pode ser coletado usando um scanner de transmissão modo como o Epson Perfection V750 PRO.
3. Criar um modelo para analisar a densidade de pixels em cada ponto da matriz utilizando um adequado programa de imaginação software de análise. Programas compatíveis incluem software ImageQuant ou ArrayVision da GE, Western sof Visãotware com modelos específicos para proteoma Matrizes Profiler, BioRad Quantidade One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ, e Alphaview proteína simples.
4. Exportar valores de sinal para um arquivo de planilha para a manipulação de um programa como o Microsoft Excel.
5. Determinar o sinal de média (densidade de pixels) do par de pontos duplicados representam cada RTK.
6. Subtrair um sinal de fundo em média a partir de cada ponto. Usar um sinal a partir de uma área livre de matriz ou pontos de controlo negativo como valor de fundo.
7. Comparar os sinais correspondentes em diferentes matrizes para determinar a variação relativa dos níveis de fosforilação de RTK entre as amostras.

4. Resultados representativos

Este protocolo demonstra como a matriz Phospho RTK-humano pode ser utilizado para rastrear os efeitos da estimulação do ligando e inibidores da fosforilação RTK. Na Figura 1, os dados são apresentados para MDA-MB-453 de células que foram tratados, tratados com 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1), durante 5 minutos, ou pré-tratados com inibidores conhecidos da família ErbB ^8-11 antes HRGβ1 tratamento. Para as experiências de inibidor, as células foram incubadas com 1 uM HDS 029, 200 nM de PD 153035 ou PD 158780 200 nM em SFM durante três horas. Cada matriz foi incubado com 100 | ig de lisado. Um aumento da fosforilação é observado para ErbB2, ErbB3, ErbB4 e pontos de captura quando comparando células não tratadas com HRG-β1 tratado MDA-MB-453 células. O tratamento das células com os três inibidores da família ErbB selectivas antes da HRG-β1 incubação causou reduções na ErbB2, ErbB3, ErbB4 e fosforilação.

Na Figura 2, os dados são apresentados para as células Kato III conhecidos para superexpressar a RTK R2 FGF. Neste conjunto de experiências, as células Kato III foram tratados, tratados com 100 ng / ml rhFGF ácido (FGF) e heparina 1 ug / ml, ou pré-tratados com inibidores selectivos R FGF ^12-15 antes do tratamento comFGF e heparina. O inibidores PD173074, PD 161570, PD 166285 e foram utilizados a uma concentração de 1 uM e foram incubadas com as células Kato III para 3 horas em meio isento de soro. Embora não haja a fosforilação constitutiva de ambos EGF R e R2 FGF em células não tratadas KATO III, um aumento na fosforilação do FGF R2 foi observada após tratamento com FGF. Incubar as células com PD 173074, PD 161570, PD 166285 ou resultou em diminuição FGF e EGF R2 fosforilação R. Embora esses inibidores são conhecidos afectar a fosforilação dos membros da família FGF R, estes resultados demonstram a utilidade da matriz Phospho RTK-humano para monitorizar o efeito de uma concentração específica de inibidor pode ter sobre outros RTKs, tais como EGF R neste caso.

Figura 1. Indução e inibição da recepfosforilação da cinase da tirosina tor em células de câncer de mama. imagens matriz de Proteome Profiler Humanos Phospho RTK-matrizes e os perfis de histograma correspondentes são mostrados. MDA-MB-453 de células não tratadas ou foram tratadas com inibidores de RTK, seguido por tratamento com NRG-β1/HRG-β1. A matriz foi utilizada para monitorar os efeitos de inibidores da quinase na fosforilação em MDA-MB-453 células. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Imagens de matriz de indução e de inibição da fosforilação do receptor de tirosina-quinase em células de cancro gástrico. Partir de uma matriz de perfis Proteome Phospho RTK-humano e os perfis correspondentes de histograma são mostrados. Células Kato III foram untreated ou tratados com inibidores de RTK, seguido de tratamento com ácido FGF e heparina. para ver figura maior .

Referências

1. Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., & Palmqvist, as células cancerosas R. colorretais ativar os fibroblastos adjacentes resultantes em FGF1/FGFR3 sinalização e invasão aumentada. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
2. Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., & Masaki, T. A utilização de proteínas de matriz para identificar receptores cinases de tirosina direccionáveis ​​para o tratamento de cancro do cólon humano. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
3. Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T. Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., & Antonescu, caracterização CR Molecular pediátricos de tumores do estroma gastrointestinal. Clin. Câncer Res. 14, 3204-3215 (2008).
4. Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., & DePinho, RA coativação de tirosina-quinases receptoras afecta a resposta das células tumorais para terapias específicas. Science. 318, 287-290 (2007).
5. Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, e Stern, DF Association of constitutivamente activada do receptor do factor de crescimento de hepatócitos (Met) com resistência a um inibidor EGFR/Her2 dupla em não-pequenas células do cancro do pulmão de células. Br. J. Câncer. 100, 941-949 (2009).
6. Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., MARYNEN, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., & Debiec-Rychter, M. Co-activated PDGFRA e EGFR são potenciais alvos terapêuticos sarcoma intimal. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010).
7. Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, & Kim, TY Combinação de EGFR e MEK1 / 2 inibidor mostra efeitos sinérgicos por EGFR/HER3-dependent suprimindo AKT ativação em células cancerosas gástricas. Mol. Ther câncer. 8, 2526-2536 (2009).
8. Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., & Bridges, propriedades bioquímicas e AJ antiproliferativa de 4 - [Ar (Alq) ilamino] piridopirimidinas, uma classe nova de produtos químicos potentes e específicos do factor de crescimento epidérmico receptor inibidor da tirosina quinase. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
9. Bos,M., Mendelsohn, J., Kim, YM, Albanell, J., Fry, DW, e Baselga, J. PD153035, um inibidor da tirosina quinase, impede a activação do receptor de crescimento epidérmico e factor de inibição do crescimento de células cancerosas em um número de receptores- forma dependente. Clin. Câncer Res. 3, 2099-2106 (1997).
10. Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, & Neoplasia Elder, JT utilização diferencial e localização de quinases de tirosina receptores ErbB na pele em comparação com os queratinócitos normais e malignas.. 3, 339-350 (2001).
11. Klutchko, SR, Zhou, H., Winters, RT, Tran, TP, Pontes, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., smaill, JB, Denny, WA, e Showalter, inibidores da quinase de tirosina de HD. 19. 6-alknyamides de 4-anilinoquinazolinas e 4-anilinopyrido [3,4-d] pirimidinas como inibidores irreversíveis da família ErbB de receptores tirosina-quinase. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
12. Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., & Lutterbach, B. FGFR2-amplificados linhas de células gástricas cancerosas necessitam de FGFR2 ErbB3 e sinalização para o crescimento e sobrevivência. Câncer Res. 68, 2340-2348 (2008).
13. Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Silva, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . & Gray, NS Uma abordagem orientada-estrutura para a criação de inibidores FGFR covalentes. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
14. Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., & Panek Inibição RL de FGF-1, a actividade de cinase de tirosina receptora de PD 161570 , uma proteína nova-Tirosina-quinase inibidor. Life Sei. 62 143-150 (1998).
15. Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, e Keiser, JA In vitro caracterização farmacológica de PD 166285, um novo potente nanomolar e amplamente activo inibidor da proteína tirosina quinase. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussão

The Human Phospho-RTK é uma alternativa econômica e rápida de métodos tradicionais, tais como imunoprecipitação (IP) ocidental para mudanças de triagem na fosforilação de TKU. Usando este método, os níveis relativos de 42 fosfo-RTKs foram rastreados simultaneamente utilizando uma única amostra de MDA-MB-453 ou de lisado de células Kato III. Além disso, este ensaio matriz exigido 2,5 horas de hands-on do tempo, tornando este método muito mais eficaz do que o tempo de realização de múltiplas IP-Westerns. Ao empregar um método de detecção por quimioluminescência, nenhum equipamento especializado para além do que é normalmente utilizado para a recolha de dados foi necessário ocidentais. Arrays são sensíveis e podem ser utilizadas para comparar mudanças na fosforilação causadas por ambos ligando e tratamento inibidor. Este método também permite a avaliação da selectividade inibidor para fora do alvo RTKs. Acertos positivos podem ser ainda avaliados utilizando um ensaio quantitativo tal como um ELISA.

Para efetivamente empregar matrizes para o rastreio de alteraçõesna fosforilação, algumas diretrizes fundamentais experimentais devem ser seguidas. Em primeiro lugar, as experiências devem incluir amostras de controlo adequadas. Por exemplo, nestas experiências o efeito de inibidores em MDA-MB-453 ou III Kato lisados ​​foram medidos em amostras de lisados ​​preparados no mesmo dia. Apenas os dados de matriz, que são recolhidos dentro da mesma experiência devem ser analisados ​​para minimizar variações de sinal, devido a diferenças no manuseamento das amostras, o tempo de incubação, a técnica de pipeta, ou a técnica de lavagem. Intensidades de sinal comparando entre dois analitos na mesma membrana não é recomendada, uma vez que os anticorpos de captura não foram seleccionadas para ter afinidades paralelas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.