Síntese de mudança de fase Nanoemulsões com distribuição de tamanho estreita para vaporização Droplet Acústico e Bubble avançada ablação por ultrassom mediada

Resumo

Phase-Shift nanoemulsões (PSNE) pode ser vaporizado utilizando ultra-sons de alta intensidade focado para melhorar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores. Neste relatório, a preparação de PSNE estável, com uma estreita distribuição de tamanho é descrito. Além disso, o impacto de PSNE vaporizada no ultra-som mediada por ablação é demonstrada no tecido mimetizam fantasmas.

Resumo

Ultra-som de alta intensidade focado (HIFU) é utilizada clinicamente para remoção térmica de tumores. Para aumentar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores, as gotas revestidas com lípido perfluorocarbonos têm sido desenvolvidos, que pode ser vaporizada por HIFU. A vasculatura em muitos tumores é anormalmente leaky devido ao seu rápido crescimento, e as nanopartículas são capazes de penetrar as fenestrações e passivamente acumulam no interior dos tumores. Assim, controlando o tamanho das gotículas pode resultar em melhor acumulação no interior dos tumores. Neste relatório, a preparação de gotas estáveis ​​em uma nanoemulsão de deslocamento de fase (PSNE), com uma estreita distribuição de tamanho é descrito. PSNE foram sintetizados por sonicação de uma solução de lípido na presença de perfluorocarbono líquido. Uma distribuição estreita de tamanhos foi obtida por extrusão das vezes PSNE múltiplas utilizando filtros com tamanhos de poros de 100 ou 200 nm. A distribuição de tamanho foi medido ao longo de um período de 7 dias usando dispersão dinâmica de luz. Polyachidrogéis rylamide contendo PSNE estavam preparados para experimentos in vitro. Gotículas PSNE nos hidrogéis foram vaporizados com ultra-sons e as bolhas resultantes melhoradas aquecimento localizado. Vaporizado PSNE permite um aquecimento mais rápido e também reduz a intensidade ultra-som necessária para a ablação térmica. Assim, espera-se que PSNE melhorar a ablação térmica em tumores, melhorando potencialmente a resultados terapêuticos do HIFU mediadas tratamentos de ablação térmica.

Protocolo

1. Preparação de mudança de fase Nanoemulsion (PSNE)

1. Dissolver 11 mg de DPPC e 1,68 mg de DSPE-PEG2000 em clorofórmio
2. Evapora-se o solvente orgânico para formar um filme de lípido seco num balão de vidro de fundo redondo de-
3. Dessicate a película lipídica durante a noite
4. Hidratar a película de lípido com 5,5 mL de salino tamponado com fosfato (PBS)
5. Solução de calor num banho de água a 45 ° C até que se dissolva filme lipídico, vortex periodicamente
6. Transferir a solução lipídica em 7 ml frasco
7. Sonicar solução de lípidos durante 2 min a 20% de amplitude
8. Dividir solução em dois frascos de 2,5 ml cada (descartar restante de 0,5 ml)
9. Adicionar 2,5 ml de PBS a cada frasco
10. Colocar cada frasco num banho de 0 ° C de água-gelo
11. Adicionar 50 ul TFDP a cada frasco
12. Sonicar cada frasco no banho de gelo-água utilizando as seguintes definições: amplitude de 25%, modo pulsado (10 seg ligado, 50 segundos desligado), total de 60 seg em vez
13. Trsoluções ansfer PSNE para 20 frascos de cintilação ml
14. Adicionar 5 ml de PBS a cada tubo, resultando em 10 ml de volume final
15. Montar direções Extrusor fornecidas pelo fabricante
    1. Lavar cada peça com água deionizada
    2. Colocar o disco de suporte de aço inoxidável no centro da base de suporte do filtro
    3. Coloque a malha de aço inoxidável em cima do disco de suporte de aço inoxidável
    4. Com uma pinça, colocar uma extrusora membrana disco de drenagem (se o lado brilhante) na malha de aço inoxidável
    5. Usando pinças, colocar o filtro de extrusora (acima do lado brilhante) na membrana de disco de drenagem
    6. Coloque cuidadosamente o pequeno-ring no filtro e colocar o Thermobarrel e superior extrusora acima da base de apoio
    7. Aperte parcialmente cada asa-porca primeiro, então completamente aperte as porcas de asa-com a mão em forma alternada
    8. Ligue o extrusor parauma linha de gás nitrogênio
    9. Para preparar o extrusor, pipeta 10 ml de água desionizada para a porta de amostra superior, limitar a abertura, e apertar a válvula de ventilação
    10. Abrir lentamente a linha de gás de azoto para aumentar a pressão, forçando a amostra através das membranas, e recolher a amostra do tubo de saída
    11. Após o uso, desmontar em ordem inversa, enxaguar as peças de extrusão com água desionizada, e descartar o filtro de membrana e do disco de membrana de drenagem
16. Para 100 nm gotas apenas, PSNE pré-condição por extrusão 10 vezes através de 200 nm filtro
17. Extrude PSNE 16 vezes através de 100 nm ou 200 nm, filtro para obter uma distribuição de tamanhos estreita

2. Preparação do hidrogel de poliacrilamida contendo PSNE

1. Preparar uma solução de 24% de BSA por diluição de 1,2 g de pó de BSA em 5 ml de água desionizada
2. Preparar a solução de APS a 10% diluído por 0,1 g de pó APS em 1 ml wate desionizadar
3. Na seguinte ordem, misturar 2,1 ml de solução de acrilamida, 1,2 ml de tampão Tris, 0,1 ml de 10% APS, 4,5 ml de 24% solução de BSA e 3,6 ml de água desionizada na câmara de plástico
4. Aquece-se a 40 ° C e colocar sob vácuo durante 1 hr
5. Adicionar 480 ul de PSNE e misturar completamente por agitação suave da câmara de plástico.
6. Adicionar 12 ul de TEMED e colocar a câmara num banho de água a 12 ° C durante 2 h

3. Resultados representativos

Um esquema da instalação de ultra-som para experiências com fantasmas tecido mimetizam de hidrogel é apresentado na Figura 1. Este protocolo resulta em gotículas de lípidos revestidos perfluorocarbono com uma distribuição estreita de tamanhos, que são estáveis ​​em solução, durante pelo menos uma semana. A distribuição do tamanho medido com dispersão de luz dinâmica (90Plus Analisador de Tamanho de Partículas, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) é mostrado na Figura 2 para PSNE extrudida utilizando 100 e 200filtros nm. O diâmetro PSNE eficaz ao longo do tempo, medida usando dispersão dinâmica de luz, está listado na Tabela 1, demonstram que PSNE são estáveis ​​durante pelo menos uma semana. B-modo as imagens de PSNE antes e depois vaporização num hidrogel de poliacrilamida são apresentadas na Figura 3. Além disso, a lesão formada por 15 segundos de HIFU mediada por aquecimento num hidrogel de poliacrilamida contendo albumina e PSNE é mostrado na Figura 4. A forma assimétrica da lesão é um resultado do aquecimento prefocal que ocorre devido à presença de uma nuvem de bolhas no caminho de ultra-som. É importante notar que o aquecimento prefocal e formação da lesão, devido à dispersão das bolhas podem ser minimizados através da redução da energia acústica transmitida.

Figura 1. Diagrama esquemático do arranjo experimental de ultra-som para experiências com tecidos mim-Icking hidrogéis.

Figura 2. Tamanho distribuição de PSNE extrudida através de 100 nm ou 200 nm, filtros, medida usando dispersão dinâmica de luz. As unidades dos eixos de ordenadas são baseados na intensidade da luz dispersa a partir de partículas de um certo tamanho em relação à intensidade total da luz dispersa a partir da amostra.

Figura 3. B-modo imagens (a) antes e (b) depois de vaporização PSNE num hidrogel de poliacrilamida. A seta indica a região focal onde uma nuvem de bolhas foi formada por vaporização PSNE.

Figura 4. Imagens de polyacrylamide hidrogel contendo albumina e PSNE (a) antes e (b), após a vaporização e sonicação com HIFU, demonstrando a formação da lesão, como resultado de ultra-som induzida pelo aquecimento. A freqüência central de ultra-som foi de 3,3 MHz. O sinal de ultra-som de um composto inicial de 30-ciclo, 6,4 W de pulso para vaporizar PSNE, imediatamente seguido de 15 segundos de ultra-som contínuo em 0,77 W.

Dias após a extrusão	Extrudido com filtro de 200 nm		Extrudido com filtro de 100 nm
	A média de Dia. (Nm)	Std. Desenv. (Nm)	A média de Dia. (Nm)	Std. Desenv. (Nm)
1	182,9	4,9	118,0	0,9
7	177,7	2,5	124,8	3,1

Tabela 1. Diâmetro médio e desvio padrão de PSNE a um e sete dias após a extrusão com 100 nm e 200 nm filtros.

Discussão

Ultra-som de alta intensidade focado (HIFU) é utilizada clinicamente para remoção térmica de tumores. ¹ Para melhorar o aquecimento localizado e melhorar a ablação térmica de tumores, as gotas revestidas com lípido perfluorocarbonos têm sido desenvolvidos, que pode ser vaporizada por HIFU. A vasculatura em muitos tumores é anormalmente leaky devido ao seu crescimento rápido. ² Assim, as nanopartículas são capazes de penetrar as fenestrações e passivamente acumular dentro de tumores, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome comum	Fabricante	Gato. Número	Nome Completo / Descrição
DPPC	Lipídios Avanti, Alabaster, AL, EUA	850355P	1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
DSPE-PEG2000	Lipídios Avanti, Alabaster, AL, EUA	880120P	1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amónio)
TFDP	Fluoromed, Round Rock, Texas, EUA	CAS: 138495-42-8	Dodecafluoropentano (C 5 F 12)
PBS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	P2194	Salina tamponada com fosfato
Clorofórmio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	372978	Clorofórmio
Acrilamida	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	A9926	40% 19:01 de acrilamida / bis-acrilamida
Tampão Tris	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	T2694	1M, pH 8, o cloridrato de trizma e base Trizma
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	A3059	Albumina de soro bovino
APS	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	A3678	Solução de persulfato de amónio
TEMED	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	87689	N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina
			Equipamento
Sonicador (3 ponta mm)	Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT, EUA	Vibra-Cell
Banho de água	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	Neslab EX-7
Extrusora	Lipídeos do Norte, em Burnaby, BC, Canadá	Lipex
Filtros extrusora	Whatman, Piscataway, NJ, EUA	Nuclepore # 110605 e # 110606
Extrusora drenagem Disco	Sterlitech Corporation, Kent, WA, EUA	# PETEDD25100
Câmara de plástico	EUA Plastic Corporation, Lima, OH, EUA	# 55288, 1 3/16 "x 1 3/16" x 2 7/16 "