A Lógica, etapas experimentais, e potencial de Biossíntese produto heteróloga Natural Apresentando o complexo antibiótico eritromicina Um produzido através<em&gt; E. coli</em

Resumo

A biossíntese heteróloga da eritromicina A através E. coli Inclui as seguintes etapas experimentais: 1) transferência genética, 2) reconstituição heteróloga, e 3) a análise do produto. Cada passo será explicado no contexto da motivação, potencial e desafios na produção de produtos naturais terapêuticos usando E. coli Como anfitrião substituto.

Resumo

A produção heteróloga de complexos produtos naturais é uma abordagem destinada a abordar as limitações atuais e possibilidades futuras. É particularmente útil para aqueles compostos que possuem um valor terapêutico, mas não pode ser suficientemente produzido ou beneficiaria de uma forma melhorada de produção. Os procedimentos experimentais envolvidos podem ser subdivididos em três componentes: 1) de transferência genética, 2) reconstituição heteróloga e 3) a análise do produto. Cada componente experimental está sob otimização contínua para enfrentar os desafios e antecipar as oportunidades associadas com esta abordagem emergentes.

Biossíntese heteróloga começa com a identificação de uma sequência genética responsável por um produto de elevado valor natural. Transferindo esta sequência para um hospedeiro heterólogo é complicado pela complexidade via biossintética responsável pela formação de produto. O antibiótico eritromicina A é um bom exemplo. Vinte genes (totalizando> 50 kb) são necessários para a biossíntese de eventual. Além disso, os três destes genes codificam megasynthases, multi-domínio enzimas cada ~ 300 kDa de tamanho. Este material genético deve ser concebida e transferido para E. coli para a biossíntese de reconstituída. A utilização de PCR isolamento, construção operon, multi-cystronic plasmídeos e transformação de electro-será descrito na transferência da eritromicina A aglomerado genético para E. coli.

Uma vez transferido, a E. coli deve suportar biossíntese eventual. Este processo é também um desafio, dadas as diferenças substanciais entre E. coli ea maioria dos hospedeiros originais responsáveis ​​pela formação do produto complexo natural. A célula deve fornecer substratos necessários para apoiar a biossíntese e coordenadamente expressar o cluster transferido genética para produzir enzimas ativas. No caso da eritromicina A, a E. coli teve de ser concebida para fornecer os dois precursores (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA), necessários para a biossíntese. Além disso, as modificações genéticas de sequência, o número de cópias do plasmídeo, chaperonina co-expressão, modificação pós-traducional, e temperatura enzimática processo também foram necessárias para permitir que a eritromicina A formação definitiva.

Finalmente, a produção de sucesso deve ser avaliado. Para a eritromicina Um caso, vamos apresentar dois métodos. A primeira é a cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) para confirmar e quantificar a produção. A bioactividade da eritromicina A também ser confirmada através da utilização de um bioensaio em que a actividade antibiótica é testado contra Bacillus subtilis. Os ensaios de avaliação estabelecem eritromicina A biossíntese de E. coli e preparou o terreno para futuros esforços de engenharia para melhorar ou diversificar a produção e para a produção de novos complexos compostos naturais usando essa abordagem.

Introdução

A eritromicina A é um antibiótico de policétido produzido pelo Gram-positiva do solo bactéria Saccharopolyspora erythraea, e na produção de corrente foi incrementalmente melhorado a ~ 10 g / L através de décadas de mutagénese tradicional e protocolos de rastreio e, mais recentemente, através de esquemas de processo de optimização ^1-6. Estratégias de mutagénese e de rastreio são comuns no desenvolvimento do produto antibiótico natural como resultado da dificuldade de cultivo e / ou manipular geneticamente hospedeiros nativos e de produção, devido à actividade antibiótica prontamente disponíveis ou fenótipos de crescimento melhoradas para auxiliar a selecção. No caso da eritromicina A, S. erythraea é limitada por um perfil de crescimento lento e à falta de mais directos técnicas de manipulação genética (em relação a organismos como E. coli), por conseguinte, dificulta uma rápida melhoria de produção e a biossíntese de novos derivados. Tendo reconhecido os problemas de produção e desbloqueado diversificatisobre as possibilidades com compostos como a eritromicina A, a comunidade científica começou a perseguir a idéia de biossíntese heteróloga (Figura 1) ^7. Estes esforços coincidiu com a informação de sequência disponível para o agrupamento de genes de eritromicina A ^8-11. Deve-se ressaltar que o número de agrupamentos de genes seqüenciados complexos naturais do produto cresceu muito ^12-16, fornecendo o impulso para os esforços contínuos na biossíntese heteróloga de acesso codificado potencial medicinal. Para fazer isso, a reconstituição heterólogo requer que o novo hospedeiro satisfazer as necessidades da via biossintética específica. E. coli oferece conveniência técnica, um conjunto amplo de abrangência de técnicas de biologia molecular e estratégias metabólicas e processos de engenharia para desenvolvimento de produtos. No entanto, quando comparado com hospedeiros de produção nativas, E. coli não apresentam o mesmo nível de produção do produto complexo natural. Por conseguinte, era desconhecido se E. coli poderia servir como uma opção viável para a biossíntese heteróloga produto complexo natural. No entanto, postulou-se que E. coli seria um organismo hospedeiro heterólogo biossíntese ideal se pudessem ser realizadas.

Com este objetivo em mente, os esforços iniciais começou a produzir a aglicona policetídeo 6-deoxyerythronolide B (6dEB) através E. coli. No entanto, E. nativo metabolismo coli não pode fornecer níveis apreciáveis ​​de o propionil-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA precursores necessários para suportar a biossíntese 6dEB nem poderia o novo hospedeiro após a tradução modificar a sintase B deoxyerythronolide (DEBS) enzimas. Para sanar esses problemas, uma via metabólica composto de enzimas nativas e heteróloga foi construído em E. coli tais que o propionato alimentados exogenamente foi convertido intracelularmente para propionil-CoA e, em seguida, (2S)-metilmalonil-CoA; durante a engenharia para completar esta via, um gene sfp foi colocado em thcromossoma e de E. coli BL21 (DE3) para a produção de uma nova estirpe designada BAP1. A enzima é uma Sfp capaz phosphopantetheinyl transferase de prender o cofactor 4'-phosphopantetheine para as enzimas DEBS ^17,18. Os três genes (DEBS cada ~ 10 kb) foram então colocados em dois vectores de expressão que contêm separadamente seleccionáveis ​​promotores induzíveis T7. Depois de um ajuste da tecla de pós-indução de temperatura (até 22 ° C), os genes de DEBS foram expressos coordenadamente dentro BAP1 num estado activo capaz de gerar 6dEB ^19.

A busca de eritromicina A biossíntese completa então começou a usar um cluster gene análogo de Micromonospora megalomicea ou um caminho híbrido composto de genes de S. erythraea, S. fradiae, e S. venezuelae que produziu a intermediários de eritromicina C e 6-desoxieritromicina D, respectivamente ^20-22. Recentemente, nosso grupo se estendeu estes esforços, produzindo erythromycin A (a forma mais clinicamente relevante de eritromicina) através de E. coli. Em contraste com trabalho anterior, a estratégia coordenadamente expressas a S. 20 original erythraea genes necessários para a biossíntese de policetido, biossíntese deoxysugar e fixação, costura adicional, e auto-resistência (Figura 2). No total, 26 (nativo e heterólogo) genes foram modificados para permitir que E. coli para produzir eritromicina A com 4 mg / L ^23,24. Esse resultado estabeleceu a produção completa de um produto complexo policetídeo natural usando E. coli e serve como base para alavancar esta opção nova produção ou buscar novos.

Protocolo

O texto a seguir é específico para o antibiótico eritromicina A, mas as etapas são concebidos para ser geralmente aplicável a outros produtos naturais como candidatos para a biossíntese heterólogo.

1. Eritromicina A transferência genética Cluster

1. Desenhar primers de PCR para amplificar todos os genes associados com a eritromicina A aglomerado dentro da S. cromossomo erythraea. Este passo é específico para os candidatos de produtos naturais cujas sequências genéticas tiverem sido determinados. Alternativamente, os genes requeridos podem ser sintetizados (por várias opções de fornecedores comerciais) com a vantagem que os genes sintetizados de novo, que se destina para o uso do codão óptimo dentro da E. novo coli hospedeira. Se a sintese de ADN é prosseguido, um desafio actual está a gerar genes megasynthase que podem exceder 10 kb de comprimento. Tecnicamente, a síntese pode ser realizada, mas é difícil e dispendioso. Prevê-se que improvem contínuaentos em tecnologia de síntese de genes irá abordar inconvenientes atuais e validar ainda mais esta abordagem para fornecer o material genético heteróloga.
2. Realizar PCR utilizando S. recentemente preparada erythraea ADN genómico como molde. O DNA cromossómico podem ser preparados a partir de culturas de S. erythraea ou a partir de stocks congelados da bactéria (Figura 3) ^25. As reacções de PCR pode beneficiar da adição de DMSO (4 ul, em 50 ul de reacções) para dar conta de alto teor de G+ C no alvo S. genes erythraea. Cada gene amplificado deve ser sequenciado para confirmar que o gene completo foi recuperado e que não foram introduzidas mutações durante o processo de PCR.
3. Através de digestão de restrição e ligação, inserir cada um dos genes isolados em vectores de expressão concebidos para E. coli (Figura 3). Isto é iniciada através da concepção de locais de restrição dentro dos iniciadores de PCR para permitir a digestão e ligação em ex adequadavectores pression (um exemplo foi incluído na Figura 3). Temos usado tanto pET21 e pET28 vetores. O vector pET28 permite a inclusão de uma sequência de 5 'líder que ajudou a expressão do gene no caso da eritromicina A. Confirmar a expressão de genes individuais através de RT-PCR, a análise de SDS-PAGE (utilizando fracções de proteína solúvel), ou convenientes ensaios fenotípicos (Figura 4).
4. Construir operons com base em genes expressos com sucesso a partir de plasmídeos de expressão individuais (Figura 3). Temos tradicionalmente utilizadas combinações de enzimas de restrição compatíveis coesivos (como Xba I e Spe I) ²⁴ para converter sequencialmente os genes de operões, no entanto, os locais de restrição escolhidas para a construção do operão não deve residir dentro (ou deve ser removido a partir do) isolado sequências de genes (um problema que pode ser evitado se a síntese do gene é usado). Esta etapa consolida a eritromicina A 20 genes antes da E. coli transformação. Actualmente, temos usado este método para incluir até 20 kb de ADN estranho num vector pET-padrão (dois genes de ~ 10 kb cada). Além disso, utilizou-se esta abordagem para gerar operons contendo nove genes. Não se sabe exactamente quanto DNA ou quantos genes podem ser integrados em pET-tipo plasmídeos, no entanto, as métricas citadas acima proporcionam uma referência para os sistemas complexos tais como a via biossintética da eritromicina. Finalmente, padrão em passos laqueadura in vitro e posteriores etapas de transformação de sucesso cada vez mais difícil como operon e aumenta o tamanho do plasmídeo. Ligadura temperatura (12-22 ° C) e do tempo (3-24 horas), são variados e electro-transformação é utilizada para auxiliar o processo de produção de construções de plasmídeos finais.
5. Transforme os plasmídeos biossintéticas recém-projetados em E. coli estirpe BAP1 utilizando electro-transformação (Figura 5). O procedimento pode ser tentada com plasmídeos introduzidas sequencialmente ou em combination. Ao transformar-size ou plasmídeos capazes numerosos, que são tradicionalmente utilizados transformação electro-(em oposição a uma transformação química). Uma vez transformado placa, as células em meio de LB contendo tetraciclina sólido (5 mg / l), carbenicilina (100 mg / l), canamicina (50 mg / l), estreptomicina (50 mg / l), e apramicina (50 mg / l ) para selecionar para a manutenção plasmídeo. É muito raro usar seis diferentes seleção antibióticos pós-transformação de um E. coli, mas isto simplesmente reflecte o número total de plasmídeos necessários para permitir a biossíntese de Eritromicina A última. Embora possível, a abordagem vai limitar as capacidades de produção do composto, uma vez cultivo começou (veja abaixo).

2. E. Reconstituição biossintética coli

1. BAP1 tensão foi projetado para fornecer os substratos necessários para a biossíntese e postar a tradução modificar o megasynthase B deoxyerythronolide. Genes individuais do erytUm caminho hromycin foram testadas para a expressão de genes e consolidados a operões em plasmídeos de expressão. Esta seção é dedicada a condições de cultura para testar a actividade concertada da eritromicina completa um caminho.
2. Leve 3 colónias separadas da BAP1 recentemente transformada e inocular 1,5 ml de LB contendo culturas os necessários antibióticos plasmídeo de selecção (nas mesmas concentrações indicadas acima, para seleccionar os transformantes em meio sólido), Isopropyl β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; 100 uM ) e arabinose (2 mg / ml) para induzir a expressão do gene, e 20 mM de sódio Propionato de suportar a formação de precursor biossintético intracelular. Uma vez que a produção tenha sido confirmada, culturas maiores podem ser realizadas na tentativa de escalar e maximizar os títulos de produto.
3. Cultura das células a 22 ° C e 250 rpm durante 24-48 horas. Neste caso, a selecção de antibiótico assegura que os plasmídeos necessários são mantidos nas fases iniciais da cultura celular. No entanto, o plasmídeos pode ser facilmente perdido como níveis de selecção de antibiótico mudar ao longo do período de cultura. Isto pode levar a uma instabilidade do plasmídeo (isto é, a perda de um ou mais plasmídeos durante a cultura), que, em seguida, limitar a capacidade de produção. O problema é exacerbado quando plasmídeos incompatíveis são usados ​​para introduzir um conjunto completo de genes heterólogos. Tal é o caso para o composto eritromicina A (Figura 5), e teriam que ser corrigidas para realmente superproduzir o composto a partir de E. coli. No entanto, para o propósito de demonstrar a produção inicial, tais falhas de design são toleradas por uma questão de rapidez estabelecer a exequibilidade da abordagem heterólogo.
4. Clarificar as culturas por centrifugação a 10.000 rpm numa microcentrífuga Eppendorf. Remover o sobrenadante e armazenar a 4 ° C para análise.
5. No caso da eritromicina A, a falta de produção de composto foi abordado pela inclusão do chaperonina GroES / EL (usando pGro7especificamente para lidar com a falta de actividade de enzimas do pós-expressão) e a inserção de cópias de genes adicionais (por esses genes suspeitos de fraca expressão / actividade). Estratégias semelhantes podem ser necessários com outros heterólogas esforços de produção de produtos naturais.

3. Análise de Produtos

1. Para confirmar e quantificar a formação de eritromicina A, injecta-se o sobrenadante da cultura para um sistema de LC-MS (Figura 6). Eritromicina A disponível comercialmente foi usado para confirmar a produção e como um padrão durante a quantificação. Para os casos sem padrões disponíveis comercialmente, LC-MS análise exigiria caracterização química adicional por RMN e espectrometria de massa de alta resolução.
2. Comparar a produção entre os três colônias / culturas da transformação BAP1. Escolha o maior produtor e preparar um estoque de glicerol da fonte colônia. Este passo pode ser realizado em paralelo com as culturas de produção de secção Protocolo2 usando uma pequena porção das culturas para preparar stocks de glicerol. Armazenar o estoque de glicerol num congelador -80 ° C.
3. Usando o banco de células mais elevada confirmada, produzindo, iniciar uma cultura de produção separada e extrai-se o sobrenadante final com um volume de acetato de etilo 2x. Usar um sistema de vácuo por evaporação para secar o extracto e ressuspender em 100 ul de metanol. Transferir o extracto para um disco de filtro estéril (~ diâmetro de 1/4 de polegada) e permite que o disco para secar. Separadamente, a cultura B. subtillis no estado líquido LB overnight. Adicionar 20 ul da B. subtilis cultura para 20 ml de agar LB líquido a 45 ° C. Agar a placa e deixa-se solidificar. Colocar o disco de filtro sobre a placa e incubar a 37 ° C (Figura 7). Alternativamente, o extracto pode ser adicionado ao meio líquido no interior de uma placa de 96 poços para quantificar a actividade, utilizando um leitor de placas (Figura 7).

Resultados

O resultado desejado da presente abordagem é a produção de um produto totalmente bioactivo natural da E. coli heterólogas de acolhimento. Isto é melhor representado pelos resultados de LC-MS utilizado para confirmar e quantificar a produção (Figura 6) e o bioensaio antibacteriano usado para confirmar a actividade final (Figura 7). No esquema geral da biossíntese heteróloga, este resultado define o sucesso. Uma vez realizado, os esforços de pesquisa, em seguida, voltar...

Discussão

Passos críticos na biossíntese heterólogo são encontradas em cada um dos três pontos de procedimento no processo: 1) a transferência genética, 2) reconstituição biossintética, e 3) análise de produto. Um problema em qualquer fase irá inviabilizar o objetivo final de estabelecer biossíntese heteróloga. Talvez o aspecto mais desafiador do processo é estabelecer biossíntese reconstituída, uma vez que este é absolutamente necessário para permitir a análise de sucesso. No entanto, a reconstituição é de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Máquina de PCR	Eppendorf	Mastercycler pessoal
Dimetil-sulfóxido (DMSO)	Pescador	BP231
Electroporator	BioRad	Micropulser
IPTG	Pescador	BP1620
Propionato de sódio	Sigma	P1880
L-arabinose	Sigma	A3256
Shaker refrigerado	Thermo Scientific	MaxQ 4000
Microcentrifugue	Eppendorf	Centrifugar 5415D
pGro7	Takara	Set acompanhante plasmídeo (3340)
pET21, pET28, PCDF-Duet-1	Merck Química	69742-3, 69864, 71340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Acetato de etilo	Sigma	270989
Metanol	Sigma	322415
Centrífuga de vácuo	Eppendorf	Concentrador de 5301
Evaporador rotativo	Buchi	R-200