Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper

Resumo

A modificação da membrana celular das células vermelhas do sangue (RBC) com poliglicerol hiper-ramificado (HPG) é apresentada. Hemácias modificadas foram caracterizadas por partição de fase aquosa dois, fragilidade osmótica e lise mediada pelo complemento. A camuflagem de proteínas de superfície e antígenos foi avaliada usando a citometria de fluxo e Sistema de Digitação Micro (MTS) cartões de fenotipagem de sangue.

Resumo

Transfusão de células vermelhas do sangue (RBC) é vital para o tratamento de um certo número de agudos e crónicos problemas médicos, tais como a talassemia major e anemia falciforme ^1-3. Devido à presença de grande número de antigénios na superfície de RBC (~ 308 antigénios conhecidos ^4), os pacientes no tratamento crónico de transfusão de sangue desenvolvem aloanticorpos devido à falta de correspondência antigénios menores sobre os glóbulos vermelhos transfundidos ^{4, 5.} A enxertia de polímeros hidrofílicos tais como polietileno glicol (PEG) e hiper-ramificado de poliglicerol (HPG) forma uma camada de exclusão da membrana de RBC que impede a interacção dos anticorpos com antigénios de superfície, sem afectar a passagem de moléculas pequenas, tais como o oxigénio, a glucose, e os iões de ^3. Actualmente, nenhum método disponível para a geração de células de dador universal vermelhas do sangue, em parte, por causa da grande desafio apresentado pela presença de um grande número de antigénios (proteínas e hidratos de carbono com base) sobre a superfície e o RBC desenvolvimento de tais métodos irá melhorar significativamente a segurança das transfusões, e melhorar drasticamente a disponibilidade eo uso de hemácias. Neste relatório, as experiências que são usados ​​para desenvolver antigénios protegidas RBCs funcionais pela membrana de enxerto de HPG e sua caracterização são apresentados. HPGs são altamente biocompatíveis polímeros compactas ^{6, 7,} e espera-se estar situado no glicocálice celular que rodeia a membrana lipídica ^{8, 9} e os antigénios de superfície da máscara ^{10, 11} de RBC.

Protocolo

A. Modificação poliglicerol hiper (SS-HPG)

1. Lugar liofilizado HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) em um balão de fundo redondo e secar durante a noite sob vácuo a 90 ° C.
2. Refrigerar o balão até à temperatura ambiente e dissolve-se o HPG secas em piridina anidra (3 ml).
3. Para funcionalizar aproximadamente oito grupos hidroxilo em grupos carboxilo com HPG, adicionar uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (uma gota de 5 mg / ml de solução em piridina) para a solução de HPG. A esta mistura, adiciona-se anidrido succínico (0,0067 g, 0,0664 mmol) dissolvido em 0,5 ml de piridina gota sábio, durante 10 min. Agita-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon.
4. Precipitar a mistura em 40 ml de acetona fria (4 ° C) num tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar utilizando uma centrífuga Beckman J2-MC a 27.000 xg durante 15 min. Decantar o sobrenadante, e remover a acetona residual por lavagem com árgon à temperatura ambiente.
5. Para ativar a carboxigrupos l com succinato succinimidilo (SS), grupos carboxilo dissolver o HPG-funcionalizado, em 3 ml de DMF anidra. Adicionar N-hidroxissuccinimida (0,0077 g, 0,0664 mmol) e N, N'-diisopropilcarbodiimida (0,0084 g, 0,0664 mmol) à solução de HPG e agitar a mistura durante a noite à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon.
6. Purifica-se o SS-HPG por precipitação em acetona fria.
7. Remover a acetona residual por lavagem com árgon.
8. Determinar a pureza das HPG modificado e o grau de funcionalização carboxilo e SS por protões ^(1H) - A análise por RMN.

B. Recolha de Sangue Total e Separação de glóbulos vermelhos (hemácias)

1. Recolha de sangue total (hematócrito de 40%, 3 ml) a partir de dadores humanos saudáveis ​​consentido em um tubo vacutainer citrato.
2. Centrifugar o tubo de citrato a 1000 xg, durante 4 min.
3. Remover o sobrenadante que contém o plasma e plaquetas, e o intermediário buffy coat que contém as células brancas do sangue e platelets, utilizando uma pipeta Pasteur.
4. Transferir RBCs embalados (80% de hematócrito, 1,2 ml) para um tubo de centrífuga de 12 ml Falcon, e adicionar o tampão PBS (8 ml, pH = 8,0) para lavar os glóbulos vermelhos.
5. Misturar por inversão RBCs para obter uma distribuição uniforme de células.
6. Centrifugar o tubo Falcon de 1.000 xg durante 4 min, e remover o sobrenadante.
7. Lavar com PBS RBCs duas vezes mais, repetindo os passos 5 e 6.
8. Colocar-embalado RBCs (100 ul) em 1,6 ml de tubo Eppendorf, e adicionar o tampão PBS (300 ul, pH = 8,0) para se obter 20% de hematócrito RBCs.

C. HPG Enxertia de hemácias

1. Imediatamente após a precipitação de HPG modificado em acetona em A6 passo, SS-HPG lugar (150 mg) num frasco de vidro (1 dram), e dissolvê-lo em tampão PBS (300 ul, pH = 8,0).
2. Adicionar SS-HPG em solução de polímero a 20% de hematócrito RBCs lavados para se obter um volume final de 400 uL e SS-HPG concentração que varia de 0,5 mm a 3 mm. Por exemplo, para preparar RBCs tratados com 0,5 mM de SS-HPG, remover 36 ul de PBS a partir do RBC lavados e colocar 36 ul de SS-HPG solução de polímero.
3. Vortex a suspensão suavemente e coloque os tubos Eppendorf num agitador orbital à temperatura ambiente durante 1 hr.
4. Centrifuga-se o tubo de Eppendorf a 1000 xg, durante 4 min, e pipetar para fora o sobrenadante.
5. Adicionar 1 ml de PBS para lavar os glóbulos vermelhos, centrifugar e remover o sobrenadante.
6. Adicionar 1 ml de solução salina e lavar os glóbulos vermelhos duas vezes como no passo 5.
7. Adicionar 300 ul de solução salina a 100 ul de RBCs embalados (80 Hematócrito%) para uma concentração final de 20% de hematócrito.

D. Caracterização da HPG Modificado RBCs

I. lise mediada por complemento

1. Recolher cerca de 8 ml de sangue completo de dadores humanos saudáveis ​​em BD vacutainer tubo de soro de vidro, e permitir que o sangue coagular à temperatura ambiente durante 30 min.
2. Centrifuga-se o tubo a 2.000 xg durante 10 minutos e recolher cerca de 3 ml de soro.
3. Um mililitro da serum foi colocado num banho de água a 60 ° C durante 30 minutos para se preparar soro inactivado pelo calor.
4. Adicionar 60 ul de soro fresco ou de soro inactivado pelo calor para um tubo Eppendorf que contêm 60 ul de 20% de hematócrito HPG RBCs modificados ou não modificados RBCs.
5. Incubar RBCs de 1 hora a 37 ° C.
6. Para quantificar a quantidade de hemoglobina na suspensão de células, lugar 5,9 ul de hematócrito de 20% de HPG RBCs modificados ou não modificados, em triplicado, as células em placa de 96 poços. Adicionar 294 ul de reagente de Drabkin (um reagente que é usado para quantificar a quantidade de hemoglobina spectrophotomerically). Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX leitor de placas 190.
7. Para quantificar a quantidade de hemoglobina no sobrenadante, centrifugar as células a 13.000 xg durante 1 min. Colocar 50 ul de sobrenadante, em triplicado, numa placa de 96 poços. Adicionar 250 ul de reagente de Drabkin do. Células misture com reagente de Drabkinpipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX leitor de placas 190.
8. Quantificar a quantidade de células lisadas a partir da razão de hemoglobina no sobrenadante (etapa 7) e a hemoglobina total na amostra (passo 6) ^{8, 11, 12.}

II. A camuflagem de antígenos maiores e menores usando MTS cartões

1. Ul local 50 de HPG modificado RBC (10% hematócrito) num tubo de Eppendorf, centrifugar a 1000 g durante 1 min, e remover o sobrenadante.
2. Adicionar 110 ul de diluente MTS para o pellet celular e homogeneizar a suspensão de células por pipetagem dentro e para fora.
3. Adicionar 11 ul de suspensão de célula para cada coluna de gel de mini. Evitar tocar o gel durante a adição.
4. Localizar cartas MTS em um suporte de cartão, centrifugue e centrifugar a 156 xg durante 6 min.
5. Protecção dos antigénios de superfície é determinada a partir da localização de RBC na mini-coluna de gel, com base na produçãor descrição.

III. Aquosas duas medições de fase de partição

1. Prepare Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa dois sistemas de separação de fases composto por (de 5% de dextrano 500k, 4% de PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM de fosfato), de acordo com ^13.
2. Centrifugar a 433 xg durante 10 min à temperatura ambiente para se obter um sistema de duas fases (o dextrano na parte inferior).
3. Separar as duas fases cuidadosamente.
4. Ml 1,0 alíquota da fase PEG superior para um tubo rotulado (com fundo côncavo), adicionar 20 ul de 20% hematócrito HPG modificado RBC, e as células misture suavemente por um movimento súbito.
5. Adicionar 0,5 ml da fase superior que contém células a 0,5 ml de uma fase inferior, e misturar o sistema suavemente passando rapidamente.
6. Colocar o tubo no banco de ~ 2 minutos para que o sistema de separar, e determinar a localização das células no sistema. Localização de RBCs (na fase de PEG superior, na fase de dextrano inferior ou em ambos) é função do grau de modificação e molecularpeso do HPG.

IV. Osmóticos medições fragilidade

1. Preparar soluções de NaCl com concentrações que variam de 0 a 0,9 (w / v)%.
2. Colocar 0,4 ml de soluções de NaCl em tubos de 1,5 ml de Eppendorf.
3. Adicionar 20 pi de glóbulos vermelhos (hematócrito de 20%) para as soluções de NaCl.
4. Mistura-se cuidadosamente as células por inversão e coloque-os num banho de água a 37 ° C durante 30 min.
5. Suspender as células cuidadosamente por inversão. Tomar 50 ul de suspensão de RBC e adicioná-lo para um 1 ml de reagente de Drabkin, colocada numa cuvete. Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Meça a absorbância da hemoglobina cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS leitor.
6. Para quantificar a quantidade de hemoglobina no sobrenadante, centrifugar as células a 1.000 xg durante 1 min. Adicionar 200 ul de sobrenadante de 1 ml de reagente de Drabkin, numa cuvete. Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da hemoglObin cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS leitor.
7. Calcula-se a quantidade de células lisadas em solução de NaCl diferente da proporção da quantidade de hemoglobina no sobrenadante (passo 6) para a quantidade total de hemoglobina em suspensão de células (passo 5).

Fluxo V. medições citometria - Proteção de Rhesus-D (Rh) antígeno

1. Adicionar 5 uL de controlo ou de HPG RBCs modificados (hematócrito de 20%), em triplicado, para tampão de PBS suplementado com BSA a 0,5% para um volume total de 25 ul.
2. Adicionar 25 uL de FITC monoclonal anti-Rhesus D (Rh) comprado de Biodiagnostics Quociente (PA, EUA).
3. Incubar a mistura durante 30 min a 37 ° C num banho de água.
4. Lava-se a mistura com 1,5 ml de tampão PBS duas vezes. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para remover o sobrenadante.
5. Suspender RBCs em 1 ml de solução salina, e transferir a suspensão para 4 ml de fluxo BD tubo de citometria de fluxo.
6. Analisar usando FACSCanto II flow citómetro, a aquisição de 5.000 eventos no portão de controle RBC, e usar os eventos inteiros para análise.

VI. Fluxo de medições de citometria - expressão de CD47

1. Adicionar 1,54 uL de controlo ou de HPG RBCs modificados (hematócrito de 20%), em triplicado, para tampão de PBS suplementado com BSA a 0,5% para um volume total de 44 ul.
2. Adicionar 6 ul de ficoeritrina (PE) anti-rato marcado humanos CD47 adquiridas da BD Biosciences (NJ, EUA).
3. Incubar a mistura durante 30 min a 37 ° C num banho de água.
4. Lava-se a mistura com 1,5 ml de tampão PBS por duas vezes. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para remover o sobrenadante.
5. Suspender RBCs em 1 ml de solução salina, e passar através de 26 G 5/8 de agulha para minimizar a aglutinação de células.
6. Transferir a suspensão em 4 de fluxo BD ml tubo de citometria de fluxo.
7. Analisar usando FACSCanto citômetro de fluxo II, adquirindo 10.000 eventos no portão de controle RBC.

Resultados

Camuflagem de antígeno Rhesus D e proteína de superfície CD47 RBC foram quantificadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos marcados fluorescentes monoclonais, e um resultado representativo é apresentado na Figura 1. Em caso de HPG-enxertadas RBCs (cinzento), a intensidade do sinal de diminuição (pico deslocado para a esquerda) em comparação com o controle de RBCs (vermelho e verde), indicando uma diminuição na ligação de anticorpos à superfície celular, que indicam o mascaramento ...

Discussão

Hemácias de doadores universais têm um grande potencial na disponibilidade de sangue e segurança para melhorar a terapia de transfusão de sangue. RBCs também são considerados veículos de entrega de drogas promissoras, devido à sua circulação longa e biocompatibilidade inerente ^{14, 15.} Experiências apresentadas neste trabalho avaliar in vitro as características de HPG RBCs modificados. A propriedades in vitro e in vivo em circulação de RBCs HPG modific...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycidol	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Trimethylolpropane	Fluka		(ON, Canada)
Metilato de potássio	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Piridina anidra	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
4-dimetilaminopiridina	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Anidrido succínico	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
Acetona	Fisher Scientific		(ON, Canada)
Dimetilformamida anidra	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N-hidroxi-succinimida	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
N, N'-diisopropilcarbodiimida	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
MTS cartões			Micro Typing System (MTS) cartões (FL, EUA)
Dextran 500 kDa	Pharmacia Fine Chemicals		(Suécia)
PEG 8 kDa	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD)	Biodiagnostics quociente		(PA, EUA)
PE monoclonal anti-CD47	BD Biosciences		(NJ, EUA)
Reagente de Drabkin	Sigma Aldrich		(ON, Canada)
			Tabela. Os produtos químicos e reagentes utilizados para a enxertia de polímeros de HPG RBC membrana e a sua análise.