Антигены охраняемых Функциональные эритроциты Мембрана прививки Компактный сверхразветвленных полиглицерины

Резюме

Модификация клеточных мембран красных кровяных телец (эритроцитов) с сверхразветвленных полиглицерина (HPG) представлены. Измененные эритроциты были характерны водной двухфазной разделов, осмотическая хрупкость и дополнения опосредованный лизис. Камуфляж поверхностных белков и антигенов оценивали с помощью проточной цитометрии и Micro System Typing (МТС) карты крови фенотипа.

Аннотация

Красные клетки крови (эритроциты) переливание имеет жизненно важное значение для лечения ряда острых и хронических медицинских проблем, таких как талассемия и серповидно-клеточная анемия ^1-3. В связи с наличием множества антигенов на поверхности эритроцитов (~ 308 известными антигенами ^4), пациентов в хронической терапии переливания крови развиваются аллоантител в связи с матчем мисс незначительных антигенов на переливание эритроцитов ^{4, 5.} Прививка гидрофильные полимеры, такие как полиэтилен гликоля (PEG) и сверхразветвленных полиглицерина (HPG) образует исключения слой на мембране эритроцитов, что препятствует взаимодействию антител с поверхностными антигенами, не влияя на прохождение малых молекул, таких как кислород, глюкоза и ионы ^3. В настоящее время ни один метод не доступен для генерации универсальных красных клеток крови донора отчасти из-за сложной проблемы, связанной с наличием большого количества антигенов (белков и углеводов основе) на поверхности эритроцитов и DРАЗВИТИЯ таких методов позволит существенно повысить безопасность переливания, а также значительно улучшить доступность и использование БС. В этом докладе, эксперименты, которые используются для разработки антигена эритроцитов охраняемой функциональной мембраной прививки HPG и их характеристика представлены. HPGs высоко биосовместимые полимеры компактная ^{6, 7,} и ожидается, что находится внутри клетки гликокаликса, которая окружает липидную мембрану ^{8, 9} и маски РБК поверхностных антигенов ^{10, 11.}

протокол

А. сверхразветвленных Модификация полиглицеридов (SS-HPG)

1. Место лиофилизированный HPG 60 кДа (0,5 г, 0,0083 ммоль) в колбу с круглым дном и просушить в течение ночи под вакуумом при 90 ° C.
2. Охладите колбу до комнатной температуры, и распустить сушеные HPG в безводном пиридине (3 мл).
3. Для функционализации примерно восемь гидроксильных групп на HPG с карбоксильными группами, добавить каталитическое количество диметиламинопиридина (одна капля 5 мг / мл раствора в пиридине) к HPG решение. К этой смеси добавляют янтарный ангидрид, (0,0067 г, 0,0664 ммоль) растворяли в 0,5 мл пиридина по каплям в течение 10 мин. Смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона.
4. Осадок смеси в 40 мл холодного ацетона (4 ° C) в 50 мл центрифужные пробирки и центрифугируют использованием Beckman J2-MC центрифуге при 27000 х г в течение 15 мин. Слейте супернатант, и удалить остатки ацетона путем промывки аргона при комнатной температуре.
5. Для активации карбоксильнойл групп с сукцинимидил сукцинат (SS) групп, растворяться карбоксильных функциональных групп HPG в 3 мл безводного DMF. Добавить N-гидроксисукцинимид (0,0077 г, 0,0664 ммоль) и N, N-диизопропилкарбодиимид (0,0084 г, 0,0664 ммоль), HPG решения и размешать смесь на ночь при комнатной температуре в атмосфере аргона.
6. Очищают SS-HPG путем осаждения в холодном ацетоне.
7. Удалите остатки ацетона путем промывки аргона.
8. Определить чистоту изменение HPG и степень карбоксильных и SS функционализации протона ⁽¹ H) - ЯМР-анализа.

B. Всего для сбора крови и разъединении красных кровяных телец (эритроцитов)

1. Сбор цельной крови (40% Гематокрит, 3 мл) с согласия здоровых человеческих доноров в трубку Vacutainer цитрата.
2. Центрифуга цитрат трубы в 1000 х г в течение 4 мин.
3. Удалить супернатант, который содержит плазму и тромбоциты, и пальто промежуточных Баффи, которая содержит лейкоциты и plateleTS помощью пипетки Пастера.
4. Передача эритроцитарной массы (80% гематокрита, 1,2 мл) в 12 мл центрифужные пробирки Falcon, и добавить PBS буфера (8 мл, рН = 8,0), чтобы вымыть эритроцитов.
5. Смешать эритроцитов обращением для получения равномерного распределения клеток.
6. Центрифуга трубки сокола в 1000 мкг в течение 4 минут и удалить супернатант.
7. Вымойте эритроцитов с PBS еще два раза, повторив шаги 5 и 6.
8. Место упакован-БС (100 мкл) в 1,6 мл трубки Эппендорф, и добавить буфера PBS (300 мкл, рН = 8,0) для получения 20% Гематокрит эритроцитов.

C. HPG Прививка в эритроцитах

1. Сразу же после осаждения изменение HPG в ацетоне в шаге A6, место SS-HPG (150 мг) в стеклянном флаконе (1 драм) и растворить его в буфере PBS (300 мкл, рН = 8,0).
2. Добавить SS-HPG раствор полимера в 20% Гематокрит промывают БС для получения конечного объема 400 мкл и SS-HPG концентрации, которая колеблется от 0,5 мм до 3 мм. Например, чтобы подготовить эритроциты обрабатывают 0,5 мМ SS-HPG, удалить 36 мкл PBS из промытого РБК и поместите 36 мкл СС-HPG раствора полимера.
3. Vortex подвеска мягко и поместить Эппендорфа на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа.
4. Центрифуга Eppendorf трубы при 1000 мкг в течение 4 мин, и пипетки из супернатанта.
5. Добавить 1 мл PBS, чтобы вымыть эритроцитов, центрифуги и удалите супернатант.
6. Добавить 1 мл физиологического раствора и промыть эритроциты два раза в шаге 5.
7. Добавить 300 мкл физиологического раствора до 100 мкл эритроцитарной массы (80% Гематокрит) до конечной концентрации 20% гематокрита.

D. Характеристика HPG изменения эритроцитов

I. Дополнение опосредованный лизис

1. Сбор около 8 мл цельной крови здоровых доноров человека в BD Vacutainer стеклянной трубки сыворотки, и позволяет крови свертываться при комнатной температуре в течение 30 мин.
2. Центрифуги трубы при 2000 мкг в течение 10 мин и собирают около 3 мл сыворотки.
3. Один миллилитр Серум была помещена в водяную баню при температуре 60 ° С в течение 30 мин для подготовки тепла инактивированной сыворотки.
4. Добавить 60 мкл свежей сыворотки или тепла инактивированной сыворотки в трубку Eppendorf, содержащие 60 мкл 20% Гематокрит HPG измененные эритроциты или немодифицированных эритроцитов.
5. Инкубируйте эритроцитов в течение 1 часа при 37 ° C.
6. Для определения количества гемоглобина в клеточной суспензии, место 5,9 мкл 20% гематокрита HPG изменения эритроцитов или немодифицированных клеток в трех экземплярах в 96-луночный планшет. Добавить 294 мкл реагента Драбкин (в реагент, который используется для определения количества гемоглобина spectrophotomerically). Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием SPECTRA MAX 190 ридер.
7. Для определения количества гемоглобина в супернатант, центрифугируют клетки при 13000 х г в течение 1 мин. Место 50 мкл супернатанта в трех экземплярах в 96-луночный планшет. Добавить 250 мкл реагента в Драбкин. Mix клеток с реагентом Драбкин вс помощью пипетки и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием SPECTRA MAX 190 ридер.
8. Определить количество лизированных клеток по отношению гемоглобина в надосадочной жидкости (шаг 7) и общего гемоглобина в образце (шаг 6) ^{8, 11, 12.}

II. Камуфляж крупных и мелких антигенов с помощью карт МТС

1. Место 50 мкл HPG изменение РБК (10% гематокрита) в трубку Eppendorf, центрифуги при 1000 х г в течение 1 мин, и удалите супернатант.
2. Добавить 110 мкл разбавителя МТС в осадок клеток и однородной суспензии клеток с помощью пипетки и выходит.
3. Добавить 11 мкл суспензии клеток в каждой мини-колонки гель. Старайтесь не прикасаться к геля в процессе добавления.
4. Найдите МТС карты в держатель карты центрифуги и центрифугируют при 156 х г в течение 6 мин.
5. Охрана поверхностных антигенов определяется из расположения РБК в мини-колонки гель, основанный на производствеГ описания.

III. Водные два измерения фазы раздела

1. Подготовка Декстран 500 кДа / PEG 8 кДа двухфазного разделения системы, состоящей из (5% декстран 500k, 4% ПЭГ-8К, 150 мМ NaCl, 10 мМ фосфат) в соответствии с ^13.
2. Центрифуга при 433 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы получить два системных этапа (декстран в нижней).
3. Отделить два этапа тщательно.
4. Алиготе 1,0 мл верхней фазы ПЭГ в меченых трубку (с вогнутым дном), добавить 20 мкл 20% гематокрита HPG изменения эритроцитов, клеток и перемешать осторожно стряхивая.
5. Добавить 0,5 мл верхней фазы, которые содержат клетки до 0,5 мл нижней фазы, и смешивать системе осторожно стряхивая.
6. Положите трубку на скамейке запасных ~ 2 мин для системы отделить и определить расположение клеток в системе. Локализация эритроцитов (в верхней фазе PEG, в нижней фазе декстран или в обоих) есть функция от степени модификации и молекулярныхвес HPG.

IV. Осмотическое измерения хрупкости

1. Подготовка NaCl решений с концентрацией в диапазоне от 0 до 0,9 (в / о)%.
2. Место 0,4 мл NaCl решений в 1,5 мл пробирок Эппендорф.
3. Добавить 20 мкл эритроцитов (20% гематокрита) в растворы NaCl.
4. Mix клетки тщательно инверсии и разместить их на водяной бане при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
5. Приостановить клетки тщательно инверсии. Принимать по 50 мкл суспензии эритроцитов и добавить его в 1 мл реагента Драбкин, в помещают в кювету. Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS читателя.
6. Для определения количества гемоглобина в супернатант, центрифугируют клетки при 1000 х г в течение 1 мин. Добавить 200 мкл супернатанта в 1 мл реагента Драбкин в кювет. Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение hemoglОБИН cyanoderivative при 540 нм с использованием BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS читателя.
7. Подсчитайте количество клеток лизируется в различных раствором хлорида натрия с отношением количества гемоглобина в надосадочной (шаг 6) на общую сумму гемоглобина в клеточной суспензии (шаг 5).

В. проточной цитометрии измерения - защита резус-D (РЖС) антигена

1. Добавьте 5 мкл управления или HPG измененные эритроциты (20% гематокрита) в трех экземплярах в PBS буфере с добавлением 0,5% BSA в общем объеме 25 мкл.
2. Добавить 25 мкл FITC моноклональными анти-резус-D (РЖС) приобретены у Quotient Biodiagnostics (штат Пенсильвания, США).
3. Выдержите смесь в течение 30 мин при 37 ° С на водяной бане.
4. Вымойте смеси с 1,5 мл PBS буфера в два раза. Центрифуга при 1000 мкг в течение 1 мин, чтобы удалить супернатант.
5. Приостановить эритроцитов в 1 мл физиологического раствора, и передать суспензии в 4 мл потока BD трубки проточной цитометрии.
6. Анализ использования FACSCanto II FloW цитометр, приобретая 5000 событий на ворота РБК контроля, а также использовать весь событий для анализа.

VI. Проточной цитометрии измерений - Экспрессия CD47

1. Добавить 1,54 мкл управления или HPG измененные эритроциты (20% гематокрита) в трех экземплярах в PBS буфере с добавлением 0,5% BSA в общем объеме 44 мкл.
2. Добавить 6 мкл фикоэритрин (PE), меченного мышиного анти-CD47 человека приобрести BD Biosciences (Нью-Джерси, США).
3. Выдержите смесь в течение 30 мин при 37 ° С на водяной бане.
4. Вымойте смеси с 1,5 мл PBS буфера два раза. Центрифуга при 1000 мкг в течение 1 мин, чтобы удалить супернатант.
5. Приостановить эритроцитов в 1 мл солевого, и пройти через 26 G 5/8 иглу, чтобы минимизировать клетки слипания.
6. Передача суспензии в 4 мл потока BD трубки проточной цитометрии.
7. Анализ использования FACSCanto II проточной цитометрии, приобретая 10000 событий на ворота РБК управления.

Результаты

Камуфляж резус-D антигена CD47 и РБК поверхности белка количественно с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентных меченых моноклональных антител, а также представитель результат приведен на рисунке 1. В случае HPG-привитые эритроцитов (серый), интенсивность си?...

Обсуждение

Универсальный эритроциты донора имеют большой потенциал в повышении доступности и безопасности крови для переливания крови терапии. Эритроциты также считают перспективным для доставки лекарств транспортных средств в связи с их долгого обращения и присущие биосовместимость ^{14, 15.}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Глицидол	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
Триметилолпропана	Fluka		(ON, Канада)
Калий метилата	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
Безводный пиридин	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
4-диметиламинопиридин	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
Ангидрида янтарной кислоты	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
Ацетон	Fisher Scientific		(ON, Канада)
Безводный диметилформамид	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
N-гидроксисукцинимида	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
N, N-диизопропилкарбодиимид	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
МТС карт			Micro Typing System (МТС) карты (Флорида, США)
Декстран 500 кДа	Pharmacia Fine Chemicals		(Швеция)
PEG 8 кДа	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
FITC моноклональными анти-резус-D (RHD)	Фактор Biodiagnostics		(Пенсильвания, США)
PE моноклональных анти-CD47	BD Biosciences		(Нью-Джерси, США)
Драбкин Реактив	Sigma Aldrich		(ON, Канада)
			Таблица. Химических веществ и реагентов, используемых для прививки HPG полимеров мембраны эритроцитов и их анализ.