O uso de matrizes de fase reversa Proteínas (RPPA) para explorar variação Protein Expression individuais dentro de câncer de células renais

Resumo

RPPA permite a expressão da proteína de centenas de amostras, impressos em lâminas de nitrocelulose para serem interrogados ao mesmo tempo, utilizando anticorpos marcados com fluorescência. Esta técnica tem sido utilizada para estudar o efeito do tratamento com medicamentos na heterogeneidade claro carcinoma de células renais.

Resumo

Actualmente não existe tratamento curativo para cancro metastático da célula clara de células renais, o mais comum dos variante da doença. Um factor chave neste resistência ao tratamento é considerado a complexidade molecular da doença ^1. Terapia-alvo, tais como o inibidor da tirosina cinase (TKI)-sunitinib têm sido utilizados, mas apenas 40% dos pacientes respondem, com a grande maioria destes pacientes recidivantes dentro de 1 ano ^2. Como tal a questão da resistência intrínseca e adquirida em pacientes com câncer de células renais é altamente relevante ^3.

Para estudar a resistência a inibidores da tirosina quinase, com o objetivo final de desenvolver tratamentos eficazes e personalizados, tecido seqüencial após um período específico de terapia-alvo é necessária, uma abordagem que tinha sido bem sucedida em mielóide crônica ⁴ leucemia. No entanto, a aplicação de uma tal estratégia em carcinoma de células renais é complicada pelo elevado nível de both heterogeneidade inter-e intra-tumoral, o que é uma característica do carcinoma de células renais, ^5,6, assim como outros tumores sólidos ^7. Heterogeneidade Intertumoral devido a diferenças transcriptomic e genética está bem estabelecido, mesmo em pacientes com apresentação semelhante, estágio e grau do tumor. Além disso, é evidente que existe uma grande heterogeneidade (intratumoral) morfológica no RCC, a qual é susceptível de representar ainda maior heterogeneidade molecular. Mapeamento detalhado e classificação de tumores CCR por análise morfológica e classificação combinada Fuhrman permite a seleção de áreas representativas para análise proteômica.

Análise de proteínas baseada em ⁸ RCC é atraente devido a sua ampla disponibilidade em laboratórios de patologia, no entanto, a sua aplicação pode ser problemática devido à disponibilidade limitada de anticorpos específicos ^9. Devido à natureza dot blot dos arrays de proteínas, em fase reversa (RPPA), a especificidade do anticorpo deve be pré-validado, como o controlo de qualidade rigoroso de tais anticorpos utilizados é de importância primordial. Apesar desta limitação, o formato dot blot não permite a miniaturização do ensaio, permitindo a impressão de centenas de amostras para uma lâmina de nitrocelulose único. Slides impressos podem então ser analisadas de uma forma semelhante à análise de Western com o uso de alvos específicos anticorpos primários e anticorpos secundários marcados com fluorescência, permitindo a multiplexagem. A expressão diferencial de proteínas em todas as amostras numa lâmina pode então ser analisados ​​simultaneamente através da comparação do nível relativo de fluorescência de uma forma mais rentável e de alto rendimento.

Protocolo

1. Identificação de morfológica e molecular Heterogeneidade Tumor

1. Os tumores removidos do congelador a -80 ° C e mantido em gelo seco.
2. Dividir os tumores em secções de cerca de 1 cm ^3. Mapear a posição original de cada secção do tumor em relação ao outro e etiqueta com um nome único. Armazenar as amostras em criotubos individuais a -80 ° C até que esteja pronto para uso.
3. Amostras do revestimento em outubro e cortar em um criostato a -22 ° C.
4. Amostras corados com Hematoxilina e Eosina método contracoloração.
5. Análise de microscopia de cortes congelados para garantir que eles são de natureza ccRCC, tumor viável e de classificação (de baixo grau, de alto grau ou mista de grau baixo / alto, desafiando a diferenciar os graus Fuhrman 1 a 4 na seção de congelados). Figura 1 a & b (coloração H & E de grau baixo e elevado misto).
6. Selecione até 4 amostras de cada região morfologicamente diferentes dentro de cada tumor para extração de proteínas.

2. Extracção de proteínas a partir de amostras de tumores

1. Corte amostra de tumor de outubro
2. Lugar 50-75 mg de tecido em tubos de 2 ml com 990 ul de tampão de lise [Tris 50 mM-HCl (pH 7,5), 5 mM de EGTA (pH 8,5), 150 mM de NaCl] suplementado com aprotinina (Sigma A6279) (10 mg / ml), a fosfatase cocktail inibidor 2 (Sigma, P5716), cocktail de inibidores de fosfatase 3 (Sigma, P0044) e um cocktail de inibidores de protease (Roche, 11836153001).
3. Adicionar uma única esfera de aço de 5 mm de cada tubo e homogeneíza-se a 50 Hz, durante 5 min duas vezes utilizando um TissueLyser, verificando o nível de homogeneização, após cada período de 5 min.
4. Transfira a amostra homogeneizada novo tubo de 2 ml usando uma pipeta de sair da esfera de aço para trás.
5. Adicionar 10 ul de Triton X-100 a cada uma das amostras antes da centrifugação a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
6. Transfira os sobrenadantes para tubos de microcentrífuga fresco.
7. Determinar a concentração de proteína utilizando o BCA ensaio (Figura 2).
8. Normalizar as concentrações de proteína a 1 mg / ml.

3. Validação de anticorpo

1. Preparar as amostras de proteína (extraído de linhas de células ou tecidos adequados) para transferência de Western e executado em um gel de 10% SDS-PAGE.
2. Transferir as amostras para uma membrana de nitrocelulose durante a noite a 4 ° C.
3. Bloquear a membrana no tampão de Li-Cor Odyssey bloqueio (50:50 diluída em PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente.
4. Diluir os anticorpos primários em Li-Cor Tampão de Bloqueio Odyssey (50:50 diluída em PBS) na diluição recomendada os fabricantes tipicamente 1 em 1000.
5. Incubar membrana em anticorpos primários durante a noite a 4 ° C.
6. Tornar-se 0,1% de PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml Tween 20/1 L de PBS).
7. Lavar membrana em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3).
8. Diluir fluorescente marcado com anticorpos secundários em Tampão de Bloqueio Odyssey (diluído em PBS, 50:50) 0,01% de SDS a diluição 1:10000 (1,5 μl/15 ml).
9. Incubar em membrana secundáriaanticorpos à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave - é importante proteger a membrana a partir da luz até ao momento em que tenha sido finalmente digitalizado.
10. Lavar membrana em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3), mantendo-se a membrana no escuro.
11. Lavar membrana em PBS à temperatura ambiente durante 5 min (x3) para remover Tween20 residual, mais uma vez mantendo a membrana no escuro.
12. Deite membrana plana sobre um pedaço de papel de filtro no escuro e deixar secar ao ar - permitindo que a membrana de secar pode melhorar o sinal e reduzir o fundo, mas tornar-se inútil para remoção e re-sondagem.
13. Digitalização da membrana no scanner Odyssey LiCor. Manter a membrana no escuro até ao momento em que tenha sido digitalizada.
14. Apenas seleccionar anticorpos que geram uma única banda predominante no peso molecular correcto. Figura 3 mostra exemplos de anticorpos aceitáveis ​​e inaceitáveis ​​para uso com RPPA.

4. RPPA PriNTING

1. Lisados ​​de proteínas foram depositados em lâminas de nitrocelulose revestidos de vidro (Fastslides-Whatman) usando um MicroGrid II robótica observador. As lâminas utilizadas continham duas almofadas sobre o qual as amostras foram manchados. Cada bloco foi manchado com amostras idênticas, neste caso, 100 amostras. Outros formatos disponíveis incluem 1, 8 e 16 lâminas almofada. Quanto maior o número de almofadas de quanto menor for o número de amostras que podem ser depositados em cada um.
2. Uma série de cinco diluições de 2 vezes foram feitas a partir de cada amostra e cada uma delas foi então visto em triplicado (resultando num total de 15 pontos por amostra).

5. Detecção de Proteína RPPA

1. Lâminas molhados em tampão LiCor excesso de bloqueio (50:50 diluída em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 1 hora numa plataforma de agitação.
2. Preparar 800 ul de anticorpos primários em LiCor tampão de bloqueio (diluído em PBS, 50:50) para as concentrações desejadas e manter em gelo.
3. Montar as lâminas em (i) Clip Chip o único frameou (ii) a quatro 'FastFrame' porta-lâminas compartimento de modo que uma vedação apertada é formado entre a lâmina e a câmara de incubação.
4. Remover o tampão residual a partir de poços e adicionar 600 uL de anticorpo primário às cavidades respectivas.
5. Colocar a lâmina e câmara em uma caixa selada húmida e incubar no balanço da plataforma durante a noite a 4 ° C.
6. Tornar-se 0,1% de PBS-Tween 20 (PBS-T, 100 ul de Tween 20/100 ml de PBS).
7. Retirar as lâminas da câmara e remova cuidadosamente os anticorpos primários de cada poço.
8. Adicionar 600 ul de PBS-T e lavagem das lâminas em balançar plataforma à temperatura ambiente durante 5 min (X3).
9. Prepare fluorescentemente marcadas com anticorpos secundários através de diluição em tampão de bloqueio Odyssey (diluído em PBS, 50:50) 0,01% de SDS a 1:2.000 de diluição (1 ul / 2 ml), em primeiro lugar.
10. Remover o tampão dos poços e adicionar 600 ul de anticorpos marcados com fluorescência, secundárias às cavidades respectivas. Incubar anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave - loÉ importante proteger a membrana a partir da luz até ao momento em que tenha sido finalmente digitalizado.
11. Remover anticorpos secundários de lavagem bem e rapidamente (3x) em 600 ul de PBS-T, à temperatura ambiente. Retirar a lâmina de suporte, a transferência para um recipiente adequado e lavar em excesso de PBS-T, durante 15 minutos, mantendo-se a membrana no escuro.
12. Remover o PBS-T e da membrana de lavagem adicional com PBS à temperatura ambiente durante 15 min para remover o residual de Tween-20, mais uma vez mantendo a membrana no escuro.
13. Seca-se o forno Fastslide em 50 ° C durante 10 min e, em seguida, digitalizar no digitalizador Odyssey Li-Cor. Mantenha o slide no escuro até que tenha sido digitalizado.
14. Digitalizar o slide a 680 nm e / ou 800 nm, dependendo do anticorpo secundário / anticorpos utilizados. Por duas cores de detecção de usar sempre altamente cross-adsorvidas anticorpos secundários para minimizar reatividade cruzada. A selecção cuidadosa de anticorpos primários e secundários é necessário para a detecção de duas cores. De importância primária é a selecção dediferentes espécies hospedeiras (coelho e rato, por exemplo) para os dois anticorpos primários. Isso permite que a discriminação por anti-coelho e rato anti-anticorpos secundários que são marcadas com corante com espectros de emissão facilmente distinguíveis.
15. Os arquivos de imagem são salvos como arquivos. Tiff. Figura 4 (imagem de arquivos digitalizados).

6. Análise de Dados

1. Lançamento do Software MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, EUA).
2. Abra. Tiff arquivo de imagem contendo a digitalização do slide RPPA.
3. Seleccionar um ficheiro de modelo predefinido que terá uma grelha para sobrepor a imagem do slide RPPA.
4. Clique no botão definir regiões de interesse (ROI), para abrir a grade.
5. Posicione a grade sobre os pontos RPPA. Figura 6a (imagem da grade sobre a imagem).
6. Clique no botão Selecionar ALL destacar tudo o ROI.
7. Clique em Localizar tudo. MicroVigene vai automaticam encontrar o ROI, encontrar os pontos, subtrair o fundo, remova a poeira e quantificar pontos.
8. Clique no botão Exibir curva de diluição para trazer os resultados para todas as amostras no slide RPPA.
9. Clique em Salvar Dados diluição.
10. À medida que cada amostra é impresso em 5 pontos a cada diluição em triplicado, são 15 pontos a analisar, o que reduz o risco de erros e melhora a qualidade do ajustamento de curva. MicroVigene produz uma logística de 4 parâmetros de registo de modelo de algoritmo "Supercurve" (Figura 6b), que incorpora todos os pontos para produzir uma curva sigmoidal de antigénio-anticorpo cinética de ligação. A suposição é que os mesmos anticorpos antígeno-cinética de ligação está ocorrendo em cada ponto da amostra, mesmo em diferentes amostras, assim, tomando todos os pontos em uma matriz para atender a uma curva de resposta comum pode aumentar a confiança do ajuste de curva ^10,11
    Y = a + ((ba) / (1 + e-(c * d-ln (x)))
    em que x é o dilution factor e Y é a intensidade do sinal.
    As amostras podem ser analisadas comparativamente, usando o valor de y0, que, em nossa análise correspondia ao valor de y no ponto médio dos valores de x, após o mapeamento aqueles para o supercurve.
11. Exportar os dados em Microsoft Excel e enredo y0 como na Figura 7.
12. Variância proteína intratumoral foi calculado separadamente para tratados e não tratados pacientes tratados em um quadro ANOVA. Distribuições de variância combinando dados a partir de todas as proteínas analisadas foram comparados pelo teste de Mann-Whitney (TMV). Variações intratumorais para proteínas individuais foram comparadas pelo teste F, onde os pressupostos de normalidade e homocedasticidade realizadas, respectivamente avaliada utilizando o Lillefours e testes Fligner; taxa de descoberta de falsas (FDR) correção foi aplicada ^12. A expressão diferencial de proteínas entre as amostras dos pacientes tratados e não tratados foi testada para cada proteína utilizando teste t de Student, onde normalidade e homocedasticidade suposiçãos foram atendidas, caso contrário, MWT foi realizada; FDR foi aplicado sobre os valores combinados t-teste e MWT ^12. Significado da expressão de proteínas e correlação de Pearson variância para as proteínas foram estimados usando uma abordagem padrão [R referência] e FDR aplicada ^12.

Resultados

Um exemplo de uma lâmina de RPPA digitalizada pode ser visto na Figura 4 (i), com ambos os canais 680 e 800 nm indicadas. Separando as imagens por comprimento de onda, a Figura 4 (ii) permite que cada bloco na corrediça RPPA a ser analisado e a expressão da proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como pode ser visto na Figura 4 (iii) a expressão de proteínas individuais através das amostras é o único com gelsolina tendo um elevado níve...

Discussão

O método aqui apresentado RPPA representa uma alternativa para a produção elevada amplamente utilizada mas comparativamente baixa taxa de transferência western blot técnica de análise de proteínas. O método permite que centenas de amostras para ser semi-quantitativamente analisadas e comparadas simultaneamente permitindo a comparação directa de proteínas-chave através de uma grande variedade de linhas celulares e amostras de tecido. Multiplexagem com espécies diferentes de anticorpos aumenta ainda mais o po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
aprotinina	Sigma	A6279
cocktail inibidor de fosfatase duas	Sigma	P5726
cocktail de inibidores de fosfatase 3	Sigma	P0044
cocktail inibidor de protease	Roche	11836153001
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey tampão de bloqueio	Li-Cor	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid II robótica spotter	Biorobotics
Quatro FastFrame 'suporte de slides baía	Whatman	10486001
Deslize FAST - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye Cabra 680LT anti-IgG	Licor	926-68020
IRDye Cabra 800CW anti-IgG de coelho	Licor	926-32211