Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia

Resumo

Neste artigo, apresentamos um método para analisar microvasos tumorais in vivo utilizando dinâmica com contraste de fluorescência videomicroscopia. Dois parâmetros quantitativos foram adquiridos: densidade capilar funcional refletindo a vascularização do tumor, e perdas de índice que reflete o vazamento de parede endotelial.

Resumo

Desfibrado de fluorescência confocal imagiologia in vivo com um feixe de fibras ópticas utiliza o mesmo princípio como microscopia confocal de fluorescência. Ele pode excitar fluorescente in situ elementos através das fibras ópticas, e depois gravar alguns dos fótons emitidos, através das mesmas fibras ópticas. A fonte de luz é um laser que emite luz de excitação através de um elemento no interior do feixe de fibras e como ele varre ao longo da amostra, uma recria a imagem de pixel por pixel. Como este tipo de exame é muito rápido, combinando-a com o software de processamento de imagem dedicada, imagens em tempo real com uma frequência de 12 quadros / s pode ser obtida.

Nós desenvolvemos uma técnica para caracterizar quantitativamente morfologia e função capilar, usando um dispositivo de fluorescência confocal videomicroscopia. O primeiro passo em nosso experimento foi gravar 5 filmes seg nos quatro quadrantes do tumor para visualizar a rede capilar. Todos os filmes foram processados ​​usando o software (ImageCell, Mauna Kea Tecnologia, Paris, França) que realiza uma segmentação automatizado de vasos em torno de um diâmetro escolhido (10 mM em nosso caso). Assim, pode quantificar o 'densidade capilar funcional ", que é a relação entre a área total do vaso, e a área total da imagem. Este parâmetro é um marcador substituto para a densidade microvascular, geralmente mensurados usando ferramentas de patologia.

O segundo passo foi a gravar filmes do tumor ao longo de 20 min para quantificar a fuga do agente de contraste macromolecular através da parede capilar para o interstício. Ao medir a proporção de intensidade de sinal no interstício em relação à dos vasos, um "índice de fuga 'foi obtida, agindo como um marcador substituto para a permeabilidade capilar.

Introdução

A angiogénese é um processo complexo que envolve ^uma formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes. As alterações patológicas da microcirculação do tecido, composta de arteríolas, capilares, e vénulas, estão implicados numa vasta gama de doenças tais como o cancro, a inflamação, ou a diabetes. Portanto, é essencial para desenvolver métodos para avaliar quantitativamente a estrutura ea função microvascular. Imagem permite o estudo de microvasos em uma não-forma ou micro-invasivo, em tempo real e in vivo, e medidas repetidas ao longo do tempo no mesmo animal ^2.

Atualmente, a dinâmica com contraste (DCE) de imagem ³ é comumente utilizado para avaliar a microcirculação do tecido. Imagem com contraste dinâmico é uma técnica que segue ao longo do tempo a biodistribuição de um traçador injetado por via intravenosa. A partir desta aquisição, parâmetros quantitativos podem ser extraídos refletindo vascularização do tecido. DCE imagemfoi o mais frequentemente usado com CT, ressonância magnética ou ultra-som. No entanto, essas técnicas de imagem não permitir a visualização directa dos microvasos, uma vez que a sua resolução, a não ser com a utilização de dispositivos experimentais específicas, na maioria das vezes permanece macroscópica.

Neste trabalho, propomos estudar a vasculatura do tumor na escala microscópica e in vivo utilizando imageamento óptico dinâmico com contraste, com fibered videomicroscopia confocal. Utilizou-se um agente de contraste macromolecular (FITC-dextrano) que permanece exclusivamente dentro de navios ou fugas através da barreira endotelial no interstício, de acordo com o seu peso molecular e as características do endotélio do tecido estudado ^4. Isso permitiu que o estudo de ambos estrutura microvasos, delineando corretamente vasos e permeabilidade capilar, por vazamento e acumulando no interstício.

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Protocolo

1. Preparação do Agente de Contraste

1. Para FITC-dextrano 70 kDa, a dose injectada é de 500 mg / kg (10 mg de FITC-dextrano diluído em 0,1 ml de solução salina por um rato pesando 20 g).
2. O agente não deve ser demasiado longo exposta à luz. Para evitar o branqueamento, é recomendado para cobrir o tubo com folha de alumínio.

2. Anestesia

1. Os ratinhos foram anestesiados por uma injecção intraperitoneal de uma mistura de 1:4 de xilazina (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, França) e cetamina (cetamina 500, Virbac, Carros, França), respectivamente, 66 mg / kg e 264 mg / kg para a 20 g mouse.

3. Preparação do órgão de interesse

1. Nós rapado dos ratinhos no local de interesse (por exemplo, ao longo de um tumor subcutâneo). Pêlos é muitas vezes auto-fluorescente quando branco. Quando preto, que absorve a luz.
2. A pele de frente para o órgão a ser trabalhada foi seccionada. É importante esperar até o bleeding parou antes de injetar o agente de contraste, caso contrário ele vai vazar no sangue e contaminam a imagem.

4. Aquisição

1. O agente de contraste foi injectado através da veia jugular ou da veia caudal ou. Há pouca ou nenhuma sinal de fundo está no órgão observados na ausência de um agente de contraste fluorescente.
2. A sonda foi colocada em frente do órgão a ser trabalhada. Em nosso estudo, este foi o tumor.
3. O laser foi ligado para iluminar o tumor e ver a fluorescência nos vasos capilares.
4. O tumor foi explorada manualmente movendo a sonda num movimento muito lento durante a gravação de visualizar a rede capilar. É importante manter uma mão firme, e essa técnica requer um pouco de experiência. Em nosso estudo, esta primeira etapa permitiu a quantificação da densidade capilar funcional.
5. O segundo passo foi a aquisição dinâmica ao longo do tempo. Para este estudo, foi utilizado um 70 kDa FITC-dextrano. Não existe nenhuma fuga intersticial na maioria dos órgãos normais, mas existe em tumores. Para adquirir imagens do mesmo local ao longo do tempo (como no nosso caso), é importante a criação de um sistema para manter a sonda na área de interesse. Isto foi feito por meio de um suporte feito à mão para manter a sonda, e colocando um pouco de gel de ultra-som na ponta da sonda. Antes de gravar, foi passado para estabilizar a sonda colocada em contacto com o tumor. Uma vez que a posição foi assegurada, só havia movimento mínima devido a respiração do mouse. O laser foi ligado para gravar as imagens 3 a cada 30 seg durante 20 min para detectar a presença de extravasamento capilar. Ele foi desligado entre cada gravação para reduzir o agente de contraste de branqueamento.
6. Na nossa experiência, os ratinhos foram sacrificados no final do procedimento para análise histológica de tumores.

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Resultados

Com os dados recolhidos, podemos analisar quantitativamente diferentes parâmetros que refletem a microcirculação.

Foram estudados in vivo, a rede vascular periférica de um tumor do cólon implantadas em ratinhos Balb-C utilizando um sistema de fluorescência confocal videomicroscopia desfibrado (Cellvizio, Maunakea Tecnologia, Paris, França ^2), após a injecção de um agente de contraste fluorescente macromolecular isotiocianato-dextrano ( FITC-dextrano) com um peso...

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Discussão

O estudo da microcirculação tumor tornou-se essencial para a compreensão da fisiopatologia do crescimento do tumor, disseminação e resposta à terapia ^1. A imagem óptica é uma das técnicas que podem ser utilizadas para observar os vasos capilares, utilizando um agente de contraste fluorescente e para quantificar morfológica (Densidade capilar funcional) e de fuga (índice) parâmetros funcionais.

A microscopia de fluorescência de imagem foram utilizados neste estudo tem ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin serynge Myjector 1ml 29G	Terumo Europe	BS-05M2913
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa	Sigma-Aldrich	01619HH	100 mg/mL diluted in saline
Fibered confocal videomicroscopy	Cellvizio - MaunaKea Technologies
Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000	Leica Microsystems	LSU-488	Store at 4 °C
Probe ProFlexTM Z	MaunaKea Technologies
Mosaicing software	MaunaKea Technologies
Vessel detection software	MaunaKea Technologies