JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем метод для анализа опухолевых микрососудов в естественных условиях с использованием динамического контрастным усилением флуоресценции видеомикроскопии. Были приобретены два количественные параметры: функциональный плотности капилляров, отражающий кровоснабжение опухоли, и утечки индекс, отражающий неплотности из эндотелиальных стенках.

Аннотация

Волокнистые конфокальной флуоресцентной в естественных изображений с светового пучка использует тот же принцип, как флуоресцентной конфокальной микроскопии. Это может возбудить флуоресцентные в элементах на места через оптические волокна, а затем записать некоторые из излучаемых фотонов, с помощью тех же оптических волокон. Источником света является лазер, который посылает возбуждающего света через элемент в расслоения и, как он сканирует по образцу, воссоздает изображения пиксель за пикселем. Как это сканирование происходит очень быстро, путем объединения его с выделенным программным обеспечением для обработки изображений, изображения в режиме реального времени с частотой 12 кадров / сек можно получить.

Мы разработали методику для количественного характеризуют капилляров морфологию и функцию, с помощью конфокальной флуоресцентной видеомикроскопии устройство. Первый шаг в нашем эксперименте было записывать 5 секунд фильмов в четырех квадрантов опухоли визуализировать капиллярную сеть. Все фильмы были обработаны с помощью программного обеспечения (яmageCell, Мауна-Кеа Технологии, Париж Франция), который выполняет автоматизированную сегментацию сосудов вокруг выбранного диаметра (10 мкм в нашем случае). Таким образом, можно количественно оценить "функциональной плотности капилляров ', который является соотношение между общей площадью сосуда и общей площади изображения. Этот параметр был суррогатным маркером плотности микрососудов, как правило, измеряется с помощью патологии инструменты.

Вторым шагом было записывать фильмы опухоли в течение 20 мин для количественного утечку макромолекулярном контрастного вещества через стенки капилляров в интерстиций. Измеряя соотношение интенсивности сигнала в интерстиции над, что в сосудах, был получен "индекс утечки", действуя в качестве суррогатного маркера проницаемости капилляров.

Введение

Ангиогенез является сложным процессом, 1, что предполагает формирование новых кровеносных сосудов из уже существующих судов. Патологические изменения в ткани микроциркуляции, состоящие из артериол, капилляров и венул, вовлечены в большом спектре заболеваний, таких как рак, воспаление, или диабет. Поэтому очень важно в разработке методов количественной оценки структуры микрососудов и функции. Изображений позволяет изучать микрососудов в не-или микро-инвазивная образом, в режиме реального времени и в естественных условиях, и повторные измерения с течением времени в той же животного 2.

В настоящее время динамического контрастным усилением (DCE) визуализации 3 обычно используется для оценки тканевой микроциркуляции. Динамическая визуализация с контрастным усилением является методом, который следует в течение долгого времени биораспределение трассера введен внутривенно. С этим приобретением, количественные параметры могут быть извлечены отражающие ткани васкуляризации. Томография DCEбыл наиболее часто используется с КТ, МРТ или УЗИ. Однако эти методы визуализации не позволяют непосредственное наблюдение микрососудов, так как их разрешение, кроме с использованием конкретных экспериментальных устройств, наиболее часто остается макроскопическим.

В этой статье мы предлагаем изучить сосудистую сеть опухоли в микроскопическом масштабе и в естественных условиях с использованием динамического оптических изображений контрастным усилением, с расслаивается конфокальной видеомикроскопии. Мы использовали макромолекулярную контрастное вещество (FITC-декстран), который остается исключительно в судах или утечек через эндотелия барьер в интерстиции, в соответствии с его молекулярной массы и характеристики эндотелия ткани изучены 4. Это позволило изучение как структуры микрососудов, по правильно разграничения сосуды и проницаемость капилляров, по протекал, и накапливается в интерстиции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Агента Contrast

  1. Для FITC-декстрана 70 кДа, доза вводится 500 мг / кг (10 мг FITC-декстран разводили в 0,1 мл физиологического раствора на мышь весом 20 г).
  2. Агент не должен подвергаться воздействию слишком долго, чтобы света. Чтобы избежать отбеливания, рекомендуется, чтобы покрыть трубу с алюминиевой фольгой.

2. Анестезия

  1. Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией смеси 1:04 ксилазина (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Франция) и кетамин (кетамин 500, Virbac, Каррос, Франция), соответственно 66 мг / кг и 264 мг / кг для 20 г мыши.

3. Подготовка органа интересов

  1. Мы побрился мышей по месту нахождения интерес (например, над подкожной опухоли). Волос животных часто самофлюоресцирующими когда белый. Когда черный, он поглощает свет.
  2. Кожа перед орган для включения в образ рассекали. Важно не ждать до кровотеченияхг остановилось перед инъекцией контрастного вещества, в противном случае он будет течь в крови и загрязнять изображение.

4. Приобретение

  1. Контрастное вещество вводили либо через яремную вену или хвостовую вену. Существует нет или мало фоновый сигнал в органе, наблюдаемой в отсутствие флуоресцентного контрастного вещества.
  2. Зонд был помещен в передней части органа для включения в образ. В нашем исследовании, это было опухоль.
  3. Лазер был включен, чтобы осветить опухоль и увидеть флуоресценцию в капиллярах.
  4. Опухоль была исследована вручную путем перемещения зонда в очень медленном движении во время записи для визуализации капиллярную сеть. Важно поддерживать устойчивый руку, и этот метод требует немного опыта. В нашем исследовании, этот первый шаг позволил количественную оценку функционального плотности капилляров.
  5. Вторым шагом было динамичным приобретение с течением времени. Для этого исследования мы использовали 70 кДа FITC-декстран. Там нет интерстициальный утечки в большинстве нормальных органов, но есть в опухоли. Чтобы получить изображения том же месте в течение долгого времени (как в нашем случае), важно создать систему для поддержания зонд на интересующей области. Это было сделано с помощью ручной поддержки, чтобы держать зонд, и путем размещения немного ультразвукового геля на кончике зонда. Перед записью времени было проведено, чтобы стабилизировать зонда в контакт с опухолью. После того, как позиция была обеспечена, был только минимальный движение из-за дыхания мыши. Лазер был включен в записи 3 изображений каждые 30 сек в течение 20 мин, чтобы обнаружить присутствие капиллярной утечки. Это был выключен между каждой съемкой для снижения контрастного вещества отбеливание.
  6. В нашем эксперименте мышей умерщвляли в конце процедуры для гистологического анализа опухолей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя данные, собранные, мы могли количественно анализировать различные параметры, отражающие микроциркуляцию.

Мы учились в естественных условиях периферических сосудов сеть опухоли толстой кишки, имплантированного в BALB-C-мышей с использованием расслаиваетс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Изучение опухоли микроциркуляции стало необходимым в понимании патофизиологии роста опухоли, распространения и реакции на лечение 1. Оптический изображений является одним из методов, которые могут быть использованы для наблюдения капилляры использованием флуоресцентного кон?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Insulin serynge
Myjector 1ml
29G		Terumo EuropeBS-05M2913
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa Sigma-Aldrich01619HH100 mg/mL
diluted in saline
Fibered confocal videomicroscopyCellvizio - MaunaKea Technologies
Calibration and Cleaning Kit for LEICAFCM1000Leica MicrosystemsLSU-488Store at 4 °C
Probe ProFlexTM ZMaunaKea Technologies
Mosaicing softwareMaunaKea Technologies
Vessel detection softwareMaunaKea Technologies

Ссылки

  1. Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
  2. Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
  3. Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
  4. Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
  5. Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
  6. Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
  7. Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
  8. Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
  9. Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
  10. Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

79FITC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены