Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

Resumo

Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.

Resumo

Um bacteriófago lítico estruturalmente transformadas tendo uma ampla gama de hospedeiros de estirpes de Staphylococcus aureus e uma proteína de ligação à penicilina (PBP 2A) contas de látex de anticorpos conjugados têm sido utilizados para criar um biossensor para a discriminação concebido resistente à meticilina (MRSA) e sensível (MSSA) S . espécies aureus ^1,2. Os fagos foram convertidos em esferóides fago pelo contato com a interface água-clorofórmio. Fago monocamadas esferóides foram movidos para uma superfície de biosensor por Langmuir-Blodgett (LB) técnica ^3. Os biossensores criados foram examinados por uma microbalança de cristal de quartzo com dissipação de rastreamento (QCM-D) para avaliar as interações bactéria-fago. Interações bactéria-esferóides levou a freqüência de ressonância reduzida e um aumento na dissipação de energia, tanto para MRSA e MSSA isolados. Após a ligação de bactérias, esses sensores têm sido ainda mais exposto ao anticorpo a proteína de ligação à penicilina esférula de látexs. Sensores analisados ​​com MRSA respondeu a PBP 2a contas de anticorpos, embora sensores inspecionados com MSSA não deu nenhuma resposta. Esta distinção experimental determina uma discriminação clara entre resistente à meticilina e S. sensível aureus. Igualmente vinculados e bacteriófagos não ligados suprimir o crescimento de bactérias nas superfícies e em suspensões de água. Uma vez fagos são transformados em esferóides, eles mantêm a sua atividade lítica forte e mostram alta capacidade de captação bacteriana. O fago e o fago esferóides pode ser utilizado para teste e de esterilização de microorganismos resistentes aos antibióticos. Outras aplicações podem incluir a utilização em terapia de bacteriófago e superfícies antimicrobianas.

Introdução

Cepas resistentes de Staphylococcus aureus meticilina têm sido apontados como um fator essencial nas infecções e surtos nosocomiais ^4-8. Formas comuns de reconhecimento de resistência à meticilina, tais como o ensaio de difusão em disco de agar oxacilina tela ou de microdiluição em caldo, dependem das condições de cultivo adaptadas para aumentar a expressão da resistência. As alterações incluem a utilização de oxacilina, incubação a 30 ou 35 ° C em vez de 37 ° C, e a inclusão de NaCl ao meio de crescimento. Além disso, para a detecção correcta por estes tipos de técnicas, um longo período de incubação de 24 horas em vez de 16 a 18 horas é necessário. Técnicas rápidos com o nível adequado (> 96%) de sensibilidade para a identificação da resistência à meticilina incluem técnicas de microdiluição automatizados tais como o GPS Vitek-SA cartão, o sistema rápido de ATB estafilococo, e o sistema de painel Microscan rápida que produzem resultados após 3-11 hr ^9-11. The Crystal MA RSA é um sistema de identificação de método rápido baseado no reconhecimento de crescimento de S. aureus na presença de 2% de NaCl e 4 mg de oxacilina por litro, com um sensor de fluorescência sensíveis ao oxigénio. Sensibilidades reivindicados variam entre 91 a 100% após 4 horas de incubação ^12-14. Estes métodos fenotípicos estão limitados nas suas precisões pelo impacto de estirpes prevalentes que expressam resistência heterogénea. Portanto, os métodos mais amplamente aceito para o reconhecimento da resistência à meticilina é PCR ou hibridização DNA do gene mecA ^15. No entanto, esta técnica requer que o ADN purificado e é extremamente sensível a vários aditivos (impurezas), que incluem fragmentos de células ^16.

Além disso, estas técnicas de precisar de um tempo para executar. Estratégias para o reconhecimento do produto do gene mecA, a proteína PBP 2a, pode ser utilizado para determinar a resistência e podem ser mais fiáveis ​​em comparação com as técnicas de ensaio padrão ^17.

Tinha sido anteriormente mostrado que bacteriófago 12600 pode ser utilizado como uma sonda de reconhecimento para as estirpes de Staphylococcus aureus, incluindo aqueles que têm resistência à meticilina ^1,2,18. Neste trabalho, proposta uma nova técnica para o reconhecimento específico e detecção de MRSA, tais como o reconhecimento de bactéria juntamente com a conformação de MRSA em tempo real. Para este fim específico a S. bacteriófago aureus com um amplo espectro de hospedeiros (incluindo MRSA), combinada com o anticorpo monoclonal contra a proteína (PBP 2as) têm sido utilizados. PBP 2a é uma proteína de parede celular, e é a causa de resistividade antibiótico de MRSA. No entanto anticorpo PBP 2a não é específico para S. aureus, uma vez que algumas bactérias possuem outras proteínas de ligação aos antibióticos com similaridade de sequência com o PBP 2a ^19,20. Por conseguinte, neste trabalho, S. bacteriófago aureus e anticorpos contra a proteína PBP 2a têm sido utilizados. Para ser capaz de desenvolver um biossensor para especificamente detectar e identificar SARM um dispositivo com uma acção em dois passos foi utilizado. O passo inicial usou um S. aureus bacteriófago monocamada como uma sonda de sensor, enquanto que o segundo passo de PBP 2a empregues anticorpos específicos. Portanto, o primeiro passo será reconhecer S. bactéria Staphylococcus, como o outro irá ser sensível à proteína de ligação ao antibiótico. Quando os sinais recebidos a partir de dois passos são positivas, isso indica a detecção específica de MRSA.

Protocolo

1. Ajustando o estágio

1. Obter estirpe S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes à meticilina de S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13 de MRSA 26 de MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13.882, o fago lítico 12600.
2. Obter anticorpos de PBP 2a de pérolas de látex conjugadas.
3. Prepara NZY meio como descrito ^21.
4. Obter uma solução salina tamponada com fosfato (PBS).
5. Prepare água deionizada como subfase de Langmuir-Blodgett (LB) deposição monocamada.

2. Propagação bacteriófago e Titulação

1. Incubar 5 ml de cultura de uma noite de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 ⁸ unidades formadoras de colónias (CFU) / ml) com 500 ul de fagos (3 x 10 ^{9 <}/ Sup> UFP / ml) em 500 ml de meio NZY em 2 L em agitador Flack-incubadora a 37 ° C durante a noite.
2. Centrifugar cultura em 4424 xg durante 10 min a 4 ° C.
3. Sobrenadante re-centrifugado a 11.325 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Filtrar o sobrenadante através de um filtro Millipore de 0,22.
5. Centrifugar o filtrado a 75.395 g durante 1,5 horas.
6. Dissolve-se o pellet em 100 ul de água destilada.
7. Preparar diluições de 10 vezes de suspensão de fagos em meio NZY.
8. Placa 1 ml de cultura overnight (ON) de S. aureus ATCC 12600 em cada uma das duas placas com agar NZY para certificar-se toda a superfície é coberta. Remover o excesso de cultura e deixe seca a superfície durante 30 minutos.
9. Manchar uma amostra (10 ul) da diluição de fago apropriado sobre a superfície da placa e incubar a 37 ^{° C} durante 18-24 horas.
10. Examinar a formação de placas e calcular o título do fago. Os títulos de bacteriófagos (t) são calculadas na base da quantidade de pLaques (N) formada por 10 mL de volume (v), da suspensão de fagos e o factor de diluição (F). O título foi calculado pela fórmula:. T = N / (VXF) Por exemplo, para o número de placas de diluição de 75 a 10 ^-7 e o volume de 10 ul (10 ^-3 x 10 ml), a titulação é igual 75 / (10 x 10 x 10 ^{-3 -7)} = 7,5 x 10 ¹⁰ unidades formadoras de placas (PFU) por ml de suspensão.

3. O fago imobilizado e ouro

1. Limpeza peças de quartzo revestidos com ouro (60 mm ²⁾ no plasma por gravura em atmosfera de árgon durante 10 min e, em seguida esterilizar por 6 horas sob luz UV num armário estéril.
2. Adicionar 50 microlitros de 1 x 10 ⁹ UFP / ml de suspensão de fago com a superfície de ouro de cada peça numa placa de Petri estéril e incubar durante a noite numa câmara húmida à temperatura ambiente.
3. Remover e titule a suspensão de fagos restantes.
4. Lave as peças com fago ligado 5 vezes com PBS para remover desacopladofago.

4. Ensaio de infecciosidade do fago imobilizado sobre uma superfície seca

1. Espalhe uma cultura de O / N de S. Aureus ATCC 12600 em uma placa de ágar NZY e permitir secagem.
2. Coloque um pedaço de ouro com fago imobilizada sobre a face da placa para baixo.
3. Observar uma zona de lise após 12 horas de incubação a 37 ° C que indica a infectividade.
4. Use peças cobertas de ouro sem fago em experimentos de controle.

5. Testes de atividade lítica de Phage livre e ligada em líquido

1. Adicionar uma cultura ON da S. aureus ATCC 12600-10 ml de NZY em cada dos quatro balões de 300 ml sidearm (6 x 10 ⁶ CFU / mL em cada frasco).
2. Adicionar Em dois frascos de 2 x 10 ⁶ PFU / ml de fago livre.
3. Use os outros dois frascos como controles.
4. Monitorizar a evoluo no tempo de S. lise celular aureus para 570 min por medição da densidade óptica (DO ₆₀₀₎ em intervalos de 30 min para todos os frascos.
5. Dê uma medição final às 24 horas.
6. Repita os passos de 5,1-5,5, mas usar peças de ouro com fagos ligados ao invés de fagos livres, e peças de ouro sem fago em frascos de controle.

6. Perda de fagos ligados durante a incubação

1. Adicionar 50 ul de 1 x 10 ⁹ UFP / ml de fago na superfície do pedaço de ouro estéril numa placa de Petri que está colocado numa câmara húmida durante a noite à temperatura ambiente.
2. Retirar a suspensão de fagos não ligados com a superfície de ouro e titulação.
3. Lava-se a peça de ouro com os fagos ligados cinco vezes com PBS e coloque em 1 ml de solução de NZY em tubo de 15 ml, agitador em incubadora a 37 ° C durante 8 horas.
4. Determinar o título do fago isolada como descrito em 2.

7. Fago Spheroids Preparação

1. Combinando 400 ul de estoque de fago 12600 suspensão (10 ¹¹ UFP / ml) com um volume igual de clorofórmio espectrofotométrica grau em 1 ml frascoà temperatura ambiente.
2. Gentilmente vórtice a suspensão de fagos-clorofórmio 5-6 vezes (intervalos de 5 seg) ao longo de um minuto de duração.
3. Permitiu a suspensão para estabilizar por 30 segundos e, em seguida, pipeta da fase superior contendo esferóides foi pipetado off para a preparação monocamada.
4. Dedique alguns microlitros da suspensão esferóides para a transmissão e microscopia eletrônica de varredura.
5. Use uma suspensão esferóide restante para a fabricação de biossensores.

8. Preparação Biosensor

1. Limpe os sensores QCM-D por plasma de gravura em argônio por 10 min PDC-32G Harrick limpo plasma.
2. Lavar o sensor com hexano para remover as impurezas orgânicas.
3. Preparar e limpar a calha do saldo filme conforme descrito em ^22.
4. Preencha através LB com uma solução subfase e limpá-lo com uma barreira de cocho e estabilizar a calha a 20 ± 0,1 ° C
5. Espalhe aliquota de 300 ul de fago 12600 em suspensi aquosoem (10 ¹¹ PFU / ml) na subfase LB.
6. Prepare monocamada fago para solução subfase LB, permitindo que 300 mL alíquota de fago suspensão aquosa 12.600 (10 ¹¹ PFU / ml) de atropelar um bastão de vidro wettable inclinado que está parcialmente submerso na subfase ^22,23.
7. Estabilizar a monocamada preparada durante 10 minutos e, em seguida comprimi-lo a uma velocidade de 30 mm / min (45 cm ² / min), a uma pressão constante até que 19 N / m é atingido.
8. Executar uma película de deposição vertical sobre o sensor posicionado perpendicular QCM-D a uma velocidade de 4,5 mm / min por meio de imersão do sensor sucessivamente dentro e fora da monocamada de sete vezes. A microscopia electrónica de depositadas monocamadas de fagos antes da exposição a bactérias amostras mostrou que as camadas eram contínuos, homogéneo e uniforme (dados não mostrados).
9. Repita os passos de 4,5-4,8 com uma suspensão de esferóide fago que é preparada em 3.
10. Use biossensores fago fabricados para detecção de MRSA, o elétronA microscopia e elipsometria.

9. Teste Biosensor, Discriminação de resistente à meticilina e bactérias Staphylococcus sensíveis

1. Neste protocolo, biossensores com fago não modificada e modificada e esferóides fago estão preparados. Um microbalança de cristal de quartzo, com quatro câmaras de fluxo do sensor é usado para monitorar a ligação de bactérias para o fago imobilizados na superfície do sensor de QCM. PBP 2a de pérolas de látex de anticorpos conjugados são utilizados para discriminar entre resistente à meticilina (MRSA), estafilococos e bactérias sensíveis. Todas as medições são realizadas em modo de fluxo (50 ul / min) a 5 MHz.
2. Estabelecer uma freqüência de ressonância linha de base do sensor QCM em água (~ 30 min).
3. Desenhar uma suspensão das células vivas de estafilococos sensíveis à meticilina bacterianas em água (10 ⁹ CFU / ml) através da célula de teste.
4. Monitorar continuamente as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação de energia para o primeiro harmônico, using o software Q-Soft.
5. Quando as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação atingiu níveis de saturação, adicionar a suspensão de esferas de látex PBP anticorpos conjugados (6,77 x10 ¹⁰ contas / ml) para o fluxo durante o monitoramento contínuo da freqüência e dissipação.
6. Repita os passos de 9,2-9,5 para células de bactérias estafilococos resistentes à meticilina (MRSA).
7. Definir uma mudança de frequência através da variação da massa, devido à ligação de pelo Sauerbrey ^24,25 equação Af =-Dm xn / C, onde C é a sensibilidade de uma massa constante (C = 17,7 ng x cm x Hz ^{-2 -1} de 5 MHz, bactérias ), m é a massa e o símbolo n representa o número harmónico (n = 1).
8. Definir uma mudança de dissipação de energia (Δ D) a partir da gravação do decaimento exponencial de oscilação (frequência e amplitude de amortecimento, que permitiu a quantificação da energia dissipada e armazenadas durante um período de oscilação,E e E _{dissipada armazenados,} respectivamente: D = E Δ _dissipada / 2 πE _armazenado. Δ D é medido em unidades de dissipação (DU), um DU = 10 ^-6 unidades relativas).

Resultados

O fago demonstrou atividade lítica contra todas as cepas testadas de S. aureus, incluindo as estirpes MRSA, como indicado pelo teste de mancha de fago. Tamanhos de placas geralmente variou de 5 a 15 mm. Sem atividade foi encontrada contra outras culturas-teste (Tabela 1).

Um crescimento normal de S. aureus ATCC 12600 em meio NZY em agitador-incubadora a 37 ° C é mostrada na Figura 1A (uma curva marcados por círculos vazios). O número d...

Discussão

É bem sabido que os fagos podem ser usados ​​como sondas de biossensor para ²⁸ agentes patogénicos bacterianos. Foi demonstrado neste trabalho que, juntamente com os anticorpos de fago PBP 2a podem ser utilizadas para resolver o problema antigo: discriminação estirpes resistentes e sensíveis a antibióticos rápidos.

Verificou-se no entanto os fagos não modificados estafilocócicas normais não são adequados para a detecção de bactérias com dispositivos QCM, embora e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools