Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

Riepilogo

Biosensori fagi litici e perline anticorpi sono in grado di discriminare tra resistente alla meticillina (MRSA) e batteri di stafilococco sensibili. I fagi sono stati immobilizzati con un metodo Langmuir-Blodgett su una superficie di un sensore microbilancia cristallo di quarzo e lavorato come larghe sonde stafilococco gamma. Perle di anticorpi riconoscono MRSA.

Abstract

Un batteriofago litico strutturalmente trasformato avere una vasta gamma di ospiti di ceppi di Staphylococcus aureus e di una proteina legante la penicillina (PBP 2a) anticorpi coniugati perle di lattice sono stati utilizzati per creare un biosensore progettato per la discriminazione di meticillino-resistente (MRSA) e sensibile (MSSA) S . specie aureus ^1,2. I fagi litici sono state convertite in sferoidi fagiche dal contatto con all'interfaccia acqua-cloroformio. Fago monostrati sferoidali sono stati spostati su una superficie biosensore da Langmuir-Blodgett (LB) tecnica ^3. I biosensori creati sono stati esaminati da una microbilancia cristallo di quarzo con il monitoraggio di dissipazione (QCM-D) per valutare le interazioni batteri-fagi. Interazioni batterio-sferoidali portato alla frequenza di risonanza ridotta e un aumento della dissipazione energetica per entrambi i ceppi MRSA e MSSA. Dopo il legame batterico, questi sensori sono stati ulteriormente esposta alla penicillina-binding protein anticorpo lattice tallones. Sensori analizzati con MRSA hanno risposto a PBP 2a perline anticorpi, anche se i sensori controllati con MSSA hanno dato alcuna risposta. Questa distinzione sperimentale determina una discriminazione univoca tra resistente alla meticillina e S. sensibile aureus. Altrettanto legati e non legati batteriofagi sopprimere la crescita batterica sulle superfici e nelle sospensioni idriche. Una volta che i fagi litici vengono trasformati in sferoidi, conservano la loro forte attività litica e mostrano un'elevata capacità di cattura batterica. Il fago e fago sferoidi possono essere utilizzati per il test e la sterilizzazione di microrganismi resistenti agli antibiotici. Altre applicazioni possono includere l'uso in terapia batteriofago e superfici antimicrobiche.

Introduzione

Ceppi meticillino-resistenti di Staphylococcus aureus sono stati suggeriti come fattore di infezioni essenziali e le epidemie nosocomiali ^4-8. Modi comuni di riconoscimento di resistenza alla meticillina, come la diffusione oxacillina prova schermo agar disco, o brodo microdiluizione, affidano a condizioni di coltura su misura per migliorare l'espressione di resistenza. Alterazioni comprendono l'utilizzo di oxacillina, incubazione a 30 o 35 ° C invece di 37 ° C, e l'inclusione di NaCl al mezzo di crescita. Inoltre, per una corretta rilevazione da questi tipi di tecniche, un lungo periodo di incubazione di 24 ore anziché 16 a 18 ore è necessaria. Tecniche rapide con appropriato livello (> 96%) di sensibilità per l'identificazione di resistenza alla meticillina comprendono tecniche microdiluizione automatici come il Vitek GPS-SA card, il sistema Rapid ATB stafilococco, e il sistema pannello Rapid Microscan che producono risultati dopo 3-11 ore ^9-11. The Crystal MID sistema RSA è un metodo rapido basato sul riconoscimento della crescita di S. aureus in presenza di 2% di NaCl e 4 mg di oxacillina per litro con un sensore di fluorescenza sensibili all'ossigeno. Sensibilità rivendicati variano tra il 91 e il 100% dopo 4 ore di incubazione di ^12-14. Questi metodi fenotipici limita le precisioni dall'impatto di ceppi prevalenti che esprimono resistenza eterogenea. Pertanto, i metodi più ampiamente accettato per il riconoscimento della resistenza alla meticillina è PCR o ibridazione DNA del gene mecA ^15. Tuttavia questa tecnica richiede DNA purificato ed è estremamente sensibile a vari additivi (impurità), che includono cellule detriti ^16.

Inoltre, queste tecniche hanno bisogno di molto tempo per eseguire. Strategie per il riconoscimento del prodotto del gene mecA, proteina PBP 2a, potrebbero essere utilizzati per determinare la resistenza e possono essere più affidabile rispetto alle tecniche di prova standard ^17.

Era stato precedentemente dimostrato che batteriofago 12600 può essere utilizzato come sonda di riconoscimento per i ceppi di Staphylococcus aureus compresi quelli aventi resistenza alla meticillina ^1,2,18. In questo lavoro abbiamo proposto una nuova tecnica nel riconoscimento specifico e la rilevazione di MRSA, come ad esempio il riconoscimento di batteri con conformazione di MRSA in tempo reale. Per questo scopo specifico di una S. batteriofago aureus con un ampio spettro di ospiti (tra cui i ceppi di MRSA) in combinazione con anticorpi monoclonali contro la proteina (PBP 2a) sono stati utilizzati. PBP 2a è una proteina della parete cellulare ed è la causa di antibiotico resistività di MRSA. Tuttavia PBP 2a anticorpo non è specifico per S. aureus da altri batteri sono proteine ​​leganti antibiotici con similarità di sequenza di PBP 2a ^19,20. Di conseguenza, in questo lavoro, S. aureus batteriofago e anticorpi contro proteine ​​PBP 2a sono stati utilizzati. Per essere in grado di sviluppare un biosensore per specificamente rilevare e identificare MRSA un dispositivo con un due stadi è stato utilizzato. Il passo iniziale utilizzato un S. aureus batteriofago monostrato come sonda sensore, mentre la seconda fase impiega anticorpi specifici PBP 2a. Pertanto, passo uno riconosceranno S. aureus batteri, come l'altra saranno sensibili alla proteina antibiotico-binding. Quando i segnali ricevuti da due passi sono positivi, indica il rilevamento specifico di MRSA.

Protocollo

1. Ponendo le basi

1. Ottenere tipo ceppo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e di Bacillus subtilis ATCC 6051. Ceppi meticillino-resistenti di S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Il fago litico 12600.
2. Ottenere PBP 2a anticorpi coniugati perle di lattice.
3. Preparare NZY media come descritto ^21.
4. Ottenere Soluzione tampone fosfato (PBS).
5. Preparare acqua deionizzata come sottofase di Langmuir-Blodgett (LB) monostrato deposizione.

2. Batteriofago Propagazione e titolazione

1. Incubare 5 ml di coltura durante la notte di S. aureus ATCC 12600 (3.6 x 10 ⁸ unità formanti colonie (CFU) / ml) con 500 ml di fago (3 x 10 ^{9 <}/ Sup> PFU / ml) in 500 ml di mezzo NZY in 2 L Flack su agitatore-incubatore a 37 ° C durante la notte.
2. Centrifugare coltura a 4.424 xg per 10 min a 4 ° C.
3. Supernatante re-centrifugati a 11.325 xg per 10 min a 4 ° C.
4. Filtrare il surnatante attraverso un filtro Millipore 0,22 micron.
5. Centrifugare il filtrato a 75.395 xg per 1,5 ore.
6. Sciogliere pellet in 100 ml di acqua distillata.
7. Preparare diluizioni di 10 volte di sospensione fago in media NZY.
8. Piastra 1 ml di una notte (ON) la cultura di S. aureus ATCC 12600 su ciascuna delle due piastre con agar NZY per assicurarsi che tutta la superficie è coperta. Rimuovere l'eccesso di cultura e di lasciare che la superficie asciutta per 30 min.
9. Individuare un campione (10 microlitri) di diluizione appropriata fago sulla superficie della piastra e incubare a ³⁷ ° C per 18-24 ore.
10. Esaminare la formazione di placche e calcolare il titolo fago. Batteriofago titoli (T) viene stimato sulla base del numero di pLaques (N) formate per 10 microlitri di volume (v) di sospensione fago e il fattore di diluizione (F). Il titolo è stato calcolato con la formula:. T = N / (VXF) Ad esempio, per il numero di placche 75 alla diluizione 10 ^-7 e il volume 10 microlitri (10 x 10 ^-3 ml), il titolo è uguale 75 / (10 x 10 x 10 ^{-3 -7)} = 7,5 x 10 ¹⁰ unità formanti placche (PFU) per ml di sospensione.

3. Phage Gold-immobilizzato

1. Pezzi di quarzo oro rivestite Clean (60 mm ²⁾ di incisione al plasma in argon per 10 minuti e poi sterilizzare per 6 ore sotto la luce UV in un armadio sterile.
2. Aggiungere 50 microlitri di 1 x 10 ⁹ PFU / ml sospensione fago alla superficie d'oro di ogni pezzo in una piastra di Petri sterile, e poi incubare una notte in una camera umida a temperatura ambiente.
3. Rimuovere e titolo per il restante sospensione fago.
4. Lavare pezzi con fago rilegato 5 volte con PBS per rimuovere non legatofago.

4. Test di Immobilizzato infettività Phage su una superficie asciutta

1. Diffondere una cultura O / N di S. Aureus ATCC 12600 su una piastra di agar NZY e lasciare asciugare.
2. Posizionare un pezzo d'oro con fago immobilizzato sul viso piatto verso il basso.
3. Osservare una zona di lisi dopo 12 ore di incubazione a 37 ° C che indica infettività.
4. Utilizzare pezzi coperti d'oro senza fago in esperimenti di controllo.

5. Test di attività litica del fago libero e legato a liquido

1. Aggiungi una cultura ON di S. aureus ATCC 12.600-10 ml di NZY in ogni dei quattro beute da 300 ml sidearm (6 x 10 ⁶ UFC / ml in ciascun pallone).
2. Aggiungi In due palloni 2 x 10 ⁶ PFU / ml di fago libero.
3. Usare gli altri due palloni come controlli.
4. Monitorare l'andamento nel tempo di S. lisi cellulare aureus per 570 min a misura di densità ottica (OD ₆₀₀₎ ad intervalli di 30 min per tutte le beute.
5. Effettuare una misurazione finale a 24 hr.
6. Ripetere i passaggi 5,1-5,5, ma utilizzare pezzi d'oro con i fagi legati invece di fagi gratuiti e monete d'oro senza fago in flaconi di controllo.

6. Perdita di fagi Bound durante l'incubazione

1. Aggiungere 50 ml di 1 x 10 ⁹ PFU / ml fago sulla superficie del pezzo oro sterile in una piastra di Petri che è posto in una camera umida notte a temperatura ambiente.
2. Rimuovere la sospensione con non legato fago dalla superficie d'oro e titolo.
3. Lavare il pezzo d'oro con fago bound 5 volte con PBS e posto in 1 ml di soluzione NZY in 15 ml di tubo in agitatore-incubatore a 37 ° C per 8 ore.
4. Determinare il titolo del fago distaccato come descritto in 2.

7. Phage Spheroids Preparazione

1. La combinazione di 400 ml di magazzino fago 12600 sospensione (10 ¹¹ PFU / ml) con un uguale volume di cloroformio spettrofotometrica di grado in 1 ml fialaa temperatura ambiente.
2. Delicatamente vortice della sospensione fago-cloroformio 5-6 volte (intervalli di 5 secondi), più di un minuto nella durata.
3. Consentito la sospensione di stabilizzare per 30 sec e poi pipetta della fase superiore contenente sferoidi è stato dispensato off per la preparazione monostrato.
4. Richiedere alcuni microlitri della sospensione sferoidi per la trasmissione e la microscopia elettronica a scansione.
5. Utilizzare un residuo sospensione sferoide per la produzione di biosensori.

8. Preparazione biosensore

1. Pulire i sensori QCM-D di incisione al plasma in argon per 10 minuti PDC-32G Harrick pulitore plasma.
2. Risciacquare sensore con esano per rimuovere eventuali impurezze organiche.
3. Preparare e pulire un trogolo del saldo pellicola come descritto in ^22.
4. Riempire LB attraverso una soluzione sottofase e pulirlo con una barriera depressione e stabilizzare la vasca a 20 ± 0,1 ° C
5. Distribuire 300 ml un'aliquota del fago 12600 in acquosa suspension (10 ¹¹ PFU / ml) su LB sottofase.
6. Preparare fago monostrato sulla soluzione sottofase LB permettendo 300 microlitri aliquota di fago 12600 sospensione acquosa (10 ¹¹ PFU / ml) a correre giù una bacchetta di vetro bagnabile inclinato che è parzialmente immerso nella sottofase ^22,23.
7. Stabilizzare il monostrato preparata per 10 minuti, e poi comprimerlo ad una velocità di 30 mm / min (45 cm ² / min) fino ad una pressione costante di 19 N / m è raggiunto.
8. Eseguire una deposizione di film sulla verticale perpendicolare realizzata sensore QCM-D ad una velocità di 4,5 mm / min in successione immersione sensore in e fuori del monostrato sette volte. Microscopia elettronica di monostrati depositati fago prima esposizione a campioni batterici mostrato che gli strati erano continui, omogeneo e uniforme (dati non mostrati).
9. Ripetere i passaggi 4,5-4,8 con una sospensione sferoide fago che viene preparato in 3.
10. Utilizzare biosensori fago fabbricato per MRSA rilevazione, elettronemicroscopia, e ellissometria.

9. Test biosensore, la discriminazione di meticillino resistente e batteri di stafilococco sensibili

1. In questo protocollo, biosensori con non modificato e modificato fago e sferoidi fagi sono preparati. Un microbalance cristallo di quarzo con quattro camere di flusso del sensore è utilizzato per monitorare legame dei batteri al fago immobilizzato sulla superficie del sensore QCM. PBP 2a anticorpi coniugati perle di lattice sono utilizzati per discriminare tra resistente alla meticillina (MRSA) e batteri di stafilococco sensibili. Tutte le misurazioni sono condotte nel modo di flusso (50 microlitri / min) a 5 MHz.
2. Stabilire una linea di base frequenza di risonanza del sensore QCM in acqua (~ 30 min).
3. Disegnare una sospensione di live meticillina sensibili stafilococco cellule batteriche in acqua (10 ⁹ CFU / ml) attraverso la cella di prova.
4. Continuamente monitorare i cambiamenti nella frequenza di risonanza sensori e dissipazione di energia per la prima armonica, USIng il software Q-Soft.
5. Quando le variazioni della frequenza di risonanza sensori e dissipazione raggiunto livelli di saturazione, aggiungere la sospensione di PBP anticorpo coniugato perle di lattice (6,77 x10 ¹⁰ perline / ml) per il flusso durante il monitoraggio continuo della frequenza e dissipazione.
6. Ripetere i passaggi 9,2-9,5 per stafilococco meticillino-resistenti cellule batteriche (MRSA).
7. Definire una variazione di frequenza attraverso la variazione di massa dovuta a batteri cogenti del Sauerbrey equazione ^24,25 Af = Δm-xn / C, dove C è la sensibilità di massa costante (C = 17,7 ng x cm x ^{-2 -1} Hz a 5 MHz ), m è la massa ed n è il numero armonico (n = 1).
8. Definire un cambiamento dissipazione energetica (Δ D) dalla registrazione il decadimento esponenziale di oscillazione (frequenza e ampiezza smorzamento, che ha permesso la quantificazione dell'energia dissipata e immagazzinato durante un periodo di oscillazione,E _dissipata ed E _memorizzati, rispettivamente: Δ D = E _dissipata / 2 πE _memorizzato. Δ S è misurata in unità di dissipazione (DU), uno = 10 ^-6 unità relative DU).

Risultati

Il fago dimostrato attività litica contro tutti i ceppi testati di S. aureus, compresi i ceppi di MRSA, come indicato dallo spot test fago. Dimensioni della placca in genere variavano da 5 a 15 mm. Nessuna attività è stata trovata contro altri test-culture (Tabella 1).

Una crescita normale di S. aureus ATCC 12600 in terreno NZY on-agitatore incubatore a 37 ° C è mostrata nella Figura 1A (una curva etichettato da cerchi vuoti). Il numer...

Discussione

E 'noto che i fagi possono essere usati come sonde biosensore per patogeni batterici ^28. Si dimostra in questo lavoro che fago insieme con anticorpi PBP 2a può essere utilizzata per risolvere il vecchio problema: ceppi resistenti e sensibili agli antibiotici discriminazione rapidi.

Si è riscontrato però quelle normali fagi stafilococciche non modificate non sono adatti al rilevamento batteri con i dispositivi QCM, anche se si legano batteri. La coda fago è così lunga che ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
			Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools