Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Resumo

Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite a imagem latente vários processos biológicos em animais vivos. Neste artigo, é apresentado um método detalhado para a imagem dinâmica das estruturas subcelulares, tais como os grânulos secretores, nas glândulas salivares de ratos vivos.

Resumo

Aqui, descrevemos um procedimento para imagem estruturas subcelulares em roedores vivo que é baseado na utilização de microscopia intravital confocal. Como um órgão modelo, usamos as glândulas salivares de ratos vivos, uma vez que oferecem várias vantagens. Em primeiro lugar, elas podem ser facilmente exposta, para permitir o acesso ao sistema óptico, e estabilizado para facilitar a redução dos artefactos de movimento devido a pulsação do coração e da respiração. Isso facilita a criação de imagens e rastreamento de pequenas estruturas subcelulares. Em segundo lugar, a maioria das populações de células das glândulas salivares são acessíveis a partir da superfície do órgão. Isto permite a utilização de microscopia confocal que possui uma resolução espacial mais elevada do que outras técnicas que têm sido usadas para imagiologia in vivo, tais como a microscopia de dois fotões. Finalmente, as glândulas salivares pode ser facilmente manipulado geneticamente e farmacologicamente, proporcionando assim um sistema robusto para investigar processos biológicos a um nível molecular.

Neste estudo, centrar-se num protocolo concebido para seguir a cinética da exocitose de grânulos de secreção em células acinares e a dinâmica da membrana plasmática apical que os grânulos de secreção, se fundem com a estimulação dos receptores beta-adrenérgicos. Especificamente, nós usamos um camundongo transgênico que co-expressa GFP citosólica e um peptídeo alvo membrana fundida com a proteína fluorescente tandem-tomate. No entanto, os processos que usamos para estabilizar e imagem das glândulas salivares pode ser alargado a outros modelos de ratinho e acoplada a outras abordagens para etiquetar in vivo de componentes celulares, permitindo a visualização de várias estruturas subcelulares, tais como endossomas, lisossomas, mitocôndrias, e o citoesqueleto de actina.

Introdução

Nas últimas duas décadas, o advento de microscopia vivo e a utilização de proteínas fluorescentes levaram a grandes avanços em cada processo celular imagináveis, avançando assim a nossa compreensão da biologia das células ^1. Este campo tem beneficiado tremendamente a utilização de culturas de células de mamíferos que são sistemas de modelos extremamente poderosos, em particular quando se trata de manipulações experimentais. No entanto, eles muitas vezes não fornecem uma representação verdadeira da biologia de organismos multicelulares complexos ^2. Essa questão começou a ser abordada pelo desenvolvimento da microscopia intravital (MIV), que abriu a porta para investigar questões biológicas fundamentais em áreas como a neurobiologia, imunologia e biologia do tumor ^3. Até agora, a maioria dos estudos baseados em IVM foram realizados a nível de tecidos e células individuais, sem fornecer qualquer informação sobre a dinâmica dos compartimentos subcelulares. Recentemente, o nosso laboratório e outross desenvolveram técnicas capazes de MIV de imagem estruturas subcelulares em roedores vivos ^{4-7, 13-15} e permitindo manipulações farmacológicas e genéticas in vivo. Esta abordagem tem sido usada por nós para estudar o tráfico de membrana in vivo, e mais especificamente a endocitose e exocitose regulada ^6,7.

Nosso sistema modelo experimental é baseado em expor, estabilizando e imagem das glândulas salivares submandibular (SG) roedores anestesiados. A escolha do SG como um modelo de órgão para IVM é devido ao facto de que as glândulas são facilmente acessíveis através da realização de uma pequena cirurgia, pode ser exteriorizada sem comprometer a sua fisiologia e estabilizado para reduzir os artefactos de movimento devido a pulsação do coração e da respiração. Além disso, a SGS pode ser selectivamente manipulada geneticamente por injecção de vectores baseados quer virais ou não virais através do ducto salivar ^8,9. Finalmente, a SGS são glândulas exócrinas compostas de epith polarizadaElial células, que formam a ácinos e as condutas, as células mioepiteliais, e uma população complexa de células estromais. Por esta razão, eles são um excelente modelo para estudar a exocitose, endocitose, a entrega do gene, e do citoesqueleto de actina, como destacado em nossos estudos recentes ^10, e oferecem a oportunidade de estudar aspectos da biologia celular, como polaridade celular, divisão celular, células- junções celulares e canais iônicos.

Neste trabalho, descrever em detalhes um protocolo de imagem para atingir resolução subcelular no epitélio das SGs de um rato vivo. Especificamente, nós mostramos como a imagem dos grânulos de secreção nas células acinares das SGs durante exocitose regulada. Como mostrado anteriormente, após estimulação com agonistas do receptor beta-adrenérgico, os grânulos de secreção fundir com a membrana plasmática apical e gradualmente colapso, libertando o seu conteúdo para o canalículos acinar ^6. Nosso objetivo é fornecer as ferramentas básicas para investigadores com mexperiência inimal em procedimentos cirúrgicos e manuseio dos animais, de modo que eles podem realizar com sucesso IVM a uma resolução subcelular. Desde a parte mais desafiadora em IVM é a preparação do animal, aqui vamos nos concentrar na descrição dos procedimentos cirúrgicos básicos que são utilizados para expor e imobilizar os SGs sem comprometer a sua função. Quanto aos procedimentos a etiquetar estruturas subcelulares diversas estratégias, tais como a entrega sistémica de sondas fluorescentes, a utilização de animais transgénicos, ou uma combinação de ambos, têm sido descritos em outros lugares ^7,11.

Protocolo

Parte 1: Microscópio e Preparação da Configuração de Imagem

1. Qualquer microscópio confocal invertido deve ser adequado para IVM. Neste estudo, um microscópio Olympus IX81 invertido, equipado com uma unidade confocal laser scanning Fluoview-1000 foi usado. Para obter a melhor resolução possível, é recomendado o uso de altos objetivos de NA, como o de imersão em água UPLSAPO 60x/1.20 NA, ea imersão em óleo Plan-Apo 60x/1.42 NA. Objectivos de imersão em óleo têm eficiências de recolha elevadas e embora eles exigem a utilização de uma lamela entre o tecido e o objectivo, que proporcionam uma melhor qualidade de imagem quando usado para áreas de imagem dentro de 15-20 um a partir da superfície. Além disso, o uso de óleo elimina a preocupação para a evaporação de água durante as sessões de imagem mais longos. A fim de manter a temperatura e humidade, o microscópio deve ser completamente fechado e alimentada com ar quente e humidificado. Alternativamente, o animal, a platina do microscópio, e aobjectivo deve ser aquecido por outros meios. Por exemplo, as almofadas de calor químico pode ser usado para o animal e a fase, e aquecedores objectivos especificamente concebidos podem ser utilizados para o objectivo (Figura 1A). O aquecedor objetivo deve ser ligada 30 minutos antes de iniciar o procedimento. Nota: quando as almofadas de calor são usados ​​para manter o animal aquecer uma gaze tem que colocar entre o bloco e a pele. A pele tem de ser monitorado para queimaduras.
2. As fases padrão na maioria dos microscópios confocais disponíveis comercialmente têm uma abertura que é usada para inserir vários suportes que são usados ​​para ajustar as lâminas, placas de Petri, e placas de diferentes tamanhos. A fim de executar IVM, uma inserção de fase normal de 35 milímetros pratos de Petri é invertida de cabeça para baixo, coberta com uma lâmina de vidro de 40 mm, que é então fixado por graxa alto vácuo de silicone ou fita adesiva (Figura 1A). Um acessório personalizado também pode ser fabricado a partir de 3 milímetros chapa de alumínio de espessura. A superfície de vidro é então cleaned com etanol a 70% e passou com um Kimwipe.
3. Fabricação titular personalizado para a imobilização SG (estabilizador). O objetivo do titular é estabilizar as SGs no lugar e rigidamente casal-los para o palco ea lamela. O suporte pode ser feito de um plástico 60 milímetros placa de Petri. Em primeiro lugar, o fundo do recipiente é retirada a partir das paredes e cortado em rectângulos de cerca de 15 x 10 mm. Em seguida, as bordas são arredondadas e polidas, usando uma lixa fina. Quatro espaçadores (1,5-2 mm) são construídas removendo as pontas de borracha de 1 ml de êmbolos de seringas. Usando uma lixa fina, a superfície dos espaçadores e os quatro cantos da peça de plástico são polidos. Os espaçadores são então colados usando supercola gelatinosa, e depois alisados ​​utilizando uma lixa fina sobre uma superfície plana. Note-se, que para os animais maiores, o tamanho dos suportes e os espaçadores podem ter de ser aumentada para acomodar glândulas ligeiramente maiores.
4. Preparação do gel de acoplamento óptico. 0,3% de Carbomer-940 (Tabela 2) em gel é preparado por aquecimento de 100 ml de água ultra-pura e dissolvendo 5,47 g de D-sorbitol. Em seguida, 0,3 g de Carbomer-940 são adicionados. A proveta deve ser coberto e colocado numa placa quente a agitação (temperatura mais baixa) durante várias horas ou até que todos os aglomerados de carbómero estão completamente dissolvidos. Finalmente, Trietanolamine é adicionada gota a gota, com agitação suave, até que um pH de cerca de 7,4 seja alcançado. O gel foi armazenado a 4 ° C ^13.

Parte 2: Animais e Anestesia

1. Antes de realizar quaisquer experimentos com animais, os protocolos devem ser aprovados por seu comitê de cuidados com os animais e ética local. É importante ressaltar que os pesquisadores devem ser devidamente treinados para realizar procedimentos cirúrgicos e devem consultar com seu comitê de cuidado animal local ou instituição veterinário antes de prosseguir com o procedimento.
2. Neste estudo, um modelo de rato (GFP / mTomato-mouse) resultantes do cruzamento camundongos FVB expressando GFP solúvel (GFP-mouse) wiForam utilizados ratos C57B6 ª expressando um peptídeo alvo membrana fundida com a proteína fluorescente tandem-tomate (mTomato-mouse) ^6. Nota: toma geralmente 20-30 minutos para que o animal se tornar totalmente anestesiado e preparado para imagens
3. Os ratos são alojados num ambiente controlado na instalação para animais e são deixados a aclimatar durante uma semana antes da experiência. Este passo é necessário para a imagem do SG desde qualquer resultado de socorro em aumento da atividade secretora ^12. Água e comida são fornecidas ad libitum. Os machos a partir de 2 -5 meses de idade são utilizados em experiências de imagem (20-30 g).
4. Antes da anestesia, pesar os animais para determinar a dose apropriada de anestésico.
5. Uma vez que a tensão induzida pela administração de anestésicos injectáveis ​​podem prejudicar a actividade secretora da SG, induzir pré-anestesia por inalação de isoflurano, seguida pela injecção de anestésicos. Para tal, colocar os ratos muito suavemente para a câmara de vaporizador, eligar o fluxo de oxigênio (800-900 mmHg). Defina os níveis de isoflurano a 3% para iniciar a indução pré-anestésica.
6. Uma vez que os animais estão inconscientes, injectar uma mistura de 100 mg / kg de cetamina e 20 mg / kg de xilazina na cavidade peritoneal (25 L de agulha). Os anestésicos são recém preparada diluindo 100 mg / ml de xilazina a 20 mg / ml em solução salina e em seguida misturando-o com a cetamina. Esta mistura é ainda diluída 1:1 com solução salina e de uma quantidade adequada é injectado com base no peso do animal. Esta diluição ajuda na prevenção de overdose acidental. Note-se que a mistura perde a sua eficácia depois de 20 min.
7. Observar os animais por sinais de vigília e injetar mais mistura anestésica se eles estão saindo da anestesia (aproximadamente 75% da dose inicial no prazo de 45 minutos após a primeira injeção, e 50% a cada hora depois). Verifique a profundidade da anestesia a cada 15 min, apertando a pata e a observação da resposta. Nota: Sempre administrar pomada oftálmica para evitarsecura ocular.
8. Anestésicos induzem hipotermia, que pode afectar a reprodutibilidade dos experimentos e a saúde do animal. Portanto, os ratinhos devem ser mantidas sob a lâmpada de calor ou sobre uma almofada de aquecimento durante todo o período da experiência. Nota: a lâmpada de aquecimento deve ser, pelo menos, 12-18 polegadas a partir do animal para impedir a queima
9. A temperatura corporal dos animais tem de ser monitorizada com um termómetro equipado com uma sonda de temperatura rectal.

Parte 3: Cirurgia Animal e Posicionamento de Microscopia intravital

1. Preparar a área de trabalho com todos os instrumentos cirúrgicos (Tabela 1) que devem ser limpos e esterilizados.
2. Raspar a área do pescoço do rato com um aparelho eléctrico. Limpar o lado ventral da área do pescoço do rato anestesiado com uma gaze embebida em etanol a 70%. Seca-se o excesso, com um Kimwipe.
3. Com pinças curvas maçantes levantar um pequeno pedaço de pele na linha média (aproximadamentemadamente, na extremidade inferior dos músculos de diafragma), e faz uma pequena incisão (Figura 1B).
4. Inserir a tesoura para a abertura e separar a pele para longe do tecido subjacente, abrindo as lâminas de tesoura. Evitar danificar o tecido glandular subjacente ao apontar a tesoura para cima para o lado de baixo da pele. Repetir este passo várias vezes, até que a pele é separada dos tecidos mais profundos (Figura 1B).
5. Com uma tesoura, corte uma tira de pele solta cerca de 3 mm de largura e 10 mm de comprimento. A pele deve ser cortada de modo a que a abertura começa perto da base dos GV de onde o nervo, a conduta e os vasos sanguíneos se conectam a glândula para o resto do corpo. Após a limpeza da área da ferida, a abertura resultante será de forma oval e medir aproximadamente 8 x 12 mm. Ambos os SGs será visível após a abertura (Figura 1B).
6. Com uma seringa de aplicação do gel de acoplamento óptico para o meio do corte e limpá-lo em direcçãoo do lado de fora com uma gaze estéril. Limpar peças de gaze deve ser usado para limpar cada um para impedir a introdução de cabelo ou sangue para o tecido exposto. Repita este passo até que todo o sangue e cabelo solto é removido.
7. Usando pinças # 7, separar o tecido conjuntivo longe da glândula submandibular direita todo o caminho até à base da glândula (alternativamente este protocolo pode ser utilizado em SG a esquerda). Em primeiro lugar, encontrar a ponta do SG e pegue o tecido conjuntivo alguns milímetros acima da ponta da glândula. Rasgue o tecido conjuntivo ao redor da glândula sem ferir o parênquima. (Figura 1B). Uma vez que a glândula está exposta, suavemente separar o tecido conjuntivo a partir da glândula. Se ocorrer sangramento, lave o sangue com soro fisiológico. Certifique-se de que todos os tecidos conjuntivos são separados ea glândula está totalmente exposta. Manter a glândula húmido por aplicação de gel de acoplamento óptico regularmente.
8. Antes de levar o animal ao microscópio, coloque um grosso pedaço de gaze e do heat embalar para a fase de microscópio de manter uma temperatura de 38 ± 2 ° C. A temperatura do bloco de calor químico pode ser ajustado pelo tamanho dos cortes que expõem a bolsa interna para a atmosfera. Gaze proporciona algum isolamento do aparelho de calor a partir da fase de metal. Cobrir o topo do aparelho de calor com um pequeno pedaço de gaze, bem.
9. Colocar o animal em seu lado (lado direito para a glândula direita) e sobre a gaze. Posicionar o animal com as glândulas salivares submandibulares colocado no meio da lamela (Figura 1C).
10. O animal deve ser protegido e estabilizado nesta posição antes de imobilização da glândula. Coloque um pedaço de fita adesiva no lado ventral da pata dianteira direita do mouse. Gancho incisivos do mouse por um fio de seda (Figura 1C, inserir). Criar alguma tensão entre o fio de seda e na pata e anexá-las para o palco por fita adesiva. O SG deve ser descansando naturalmente no meio dolamela. A cabeça e no tórax deve ser adicionalmente estabilizados por cunhas de plástico que podem ser acoplados à fase.
11. Coloque um pequeno pedaço de tecido de limpeza de lentes sobre a glândula (Figura 1C). Estender a glândula ligeiramente e coloque um suporte personalizado sobre a glândula. Fortemente par do estabilizador para o palco com fita adesiva. O acoplamento pode ser melhorada através de uma braçadeira de metal ligado à fase (Figura 1C). Ângulos de tensão e pontiagudos devem ser evitados, pois podem comprometer o fluxo de sangue. Imediatamente após a estabilização inspecionar o fluxo de sangue ou através do exame da glândula visualmente (que deve reter a coloração rosa) ou por epifluorescência. No rato GFP / m-tomate, alterações macroscópicas do fluxo sanguíneo pode ser facilmente avaliada uma vez que ambos os vasos sanguíneos e várias das células sanguíneas são rotulados com o m-tomate.
12. Cobrir o animal com uma almofada de gaze e aquecida. Medir a temperatura da glândula expostos por meio de um termómetro equipado wom uma pequena sonda de termopar flexível colocado em contacto com um dos lados da glândula exposta.

Parte 4: Parâmetros de imagem

1. Usando epifluorescência foco iluminação na superfície da glândula quer utilizando o GFP ou o conjunto de filtro de RFP. Encontrar a superfície da SG, e avaliar o fluxo sanguíneo nos vasos capilares e a morfologia global do tecido. Os sinais de danos nos tecidos incluem Blebbing membrana ou o aparecimento de grandes vacúolos.
2. Avaliar a estabilidade do tecido, quer através de epifluorescência ou por pré-digitalizar a área selecionada. A preparação estável é essencial, pois a maioria dos artefatos de movimento não pode ser removido ou corrigido para a análise dos dados pós-processamento. Se a preparação não é estável, são necessários ajustes.
3. Para encontrar a imagem adequada plano focal das glândulas no modo de pré-varredura (1X zoom), e mover-se gradualmente o objetivo para a lamela até as estruturas acinares, os grânulos de secreção e da pmembrana LASMA tornar claramente visíveis (Figura 2).
4. Os parâmetros de imagem para o lapso de tempo depende da experiência individual. Para imagem da dinâmica dos grânulos secretores usar uma velocidade de digitalização de 0,5-2 seg / frame, e 256 x 256 pixels com 0,2 m / pixel escala espacial (campo de visão de aproximadamente 50 mm x 50 mm). A fim de visualizar melhor forma os grânulos e a membrana do plasma, a espessura óptica deve ser ajustado entre 0,9-1,2 um. Para excitar o GFP e a tandem tomate, pode-se usar um comprimento de onda de 488 nm e 561 nm, respectivamente. A potência de pico é definido em torno de 0,5 mW para a 488 nm e 1 mW para a 561 nm. Isto assegura fotobranqueamento mínimo.
5. As definições do detector tem de ser ajustada para manter o sinal dentro da gama dinâmica e depende da luminosidade do espécime.
6. Uma vez que todos os parâmetros são definidos, a imagem pode ser iniciado. Em primeiro lugar, tirar uma foto do campo de visão para ser usado como um ponto de referência. Enquantoimagem em lapso de tempo, deriva do tecido em XY e Z podem ocorrer. Isso pode ser compensado manualmente ajustando a área de digitalização e da posição Z. Os ajustes devem ser feitos de forma gradual e em pequenos incrementos para evitar artefatos. Além disso, a imagem de referência pode ser utilizada para determinar se ocorre a fotodegradação. Se for detectada a fotodegradação significativa (redução de mais de 15-20% da fluorescência), reduzir a potência de laser de 0,1 mW.
7. Para estimular exocitose, injectar por via subcutânea 0,1 mg / kg de uma solução recentemente preparada de isoproterenol em solução salina. A exocitose é accionado a cerca de 1 minuto após a injecção. Grânulos de secreção de fusão com a membrana plasmática será detectado por um aumento da fluorescência da GFP em torno dos grânulos e a difusão dos péptidos em tandem de tomate nas suas membranas limitantes (Figura 3). Recomendamos adquirir 3-4 seqüências de lapso de tempo na mesma área, 10 min cada.
8. Após a sessão de imagens, eutanásia do anesthetized animais por inalação de _CO2, numa câmara eutanásia (10-12 mm Hg durante 10 minutos).

Resultados

No GFP / mTomato mouse, os ácinos aparecem como estruturas claramente distintos, que expressam GFP citosólica e direcionada à membrana tandem-Tomate peptídeo (Figura 2, linha quebrada). Em ácinos indivíduo, células acinares são delineadas por o péptido em tandem de tomate. GFP é também detectado nos núcleos que são claramente visíveis no interior das células acinares (Figura 2, as setas). GFP citosólica é excluído dos grânulos secretores que aparecem vesículas circul...

Discussão

Até agora estruturas subcelulares foram fotografadas principalmente em in vitro (ou seja, culturas de células) ou ex vivo (ou seja, organiza-culturas, fatias de tecido, preparações acinares) sistemas modelo que muitas vezes não recapitulam as características dos tecidos vivos intactos ^6. Nesse sentido, a abordagem aqui apresentada representa um grande avanço, pois permite imaginando a dinâmica de um passo tráfico de membrana específico (ou seja, exocitose regulada) em rato...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)	Braintree Scientific	190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter	Hazard Technology	PDDT
Heat lamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight	World Precision Instruments	5003708-12
#7 curved tip tweezers	World Precision Instruments	14187
Microscissors	World Precision Instruments	503365
Black Braided Silk suture #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gauze sponges 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Lens cleaning tissue	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476