Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Riepilogo

La microscopia intravitale è un potente strumento che permette l'imaging vari processi biologici di animali vivi. In questo articolo, presentiamo un metodo dettagliato per l'imaging la dinamica di strutture subcellulari, come granuli secretori, nelle ghiandole salivari di topi vivi.

Abstract

Qui si descrive un procedimento per immagine strutture subcellulari nei roditori vivi che si basa sull'utilizzo di microscopia confocale intravitale. Come modello organo, usiamo le ghiandole salivari di topi vivi quanto forniscono diversi vantaggi. Primo, possono essere facilmente esposti per consentire l'accesso alle ottiche, e stabilizzato per facilitare la riduzione degli artefatti da movimento dovuti il ​​battito cardiaco e la respirazione. Questo facilita notevolmente l'imaging e il monitoraggio di piccole strutture subcellulari. In secondo luogo, la maggior parte delle popolazioni cellulari delle ghiandole salivari sono accessibili dalla superficie dell'organo. Questo permette l'utilizzo di microscopia confocale che ha una risoluzione spaziale di altre tecniche che sono state utilizzate per l'imaging in vivo, come la microscopia a due fotoni. Infine, ghiandole salivari possono essere facilmente manipolati geneticamente e farmacologicamente, fornendo così un sistema robusto per studiare processi biologici a livello molecolare.

In questo studio ci concentriamo su un protocollo progettato per seguire la cinetica di esocitosi di granuli secretori in cellule acinose e la dinamica della membrana plasmatica apicale in cui i granuli secretori fusibile a stimolazione dei recettori beta-adrenergici. In particolare, abbiamo utilizzato un topo transgenico che co-esprime citosolica GFP e un peptide membrana mirata fusa con la proteina fluorescente tandem-pomodoro. Tuttavia, le procedure che abbiamo usato per stabilizzare e l'immagine delle ghiandole salivari può essere esteso ad altri modelli del mouse e accoppiati ad altri approcci per etichettare componenti cellulari in vivo, permettendo la visualizzazione di varie strutture subcellulari, come endosomi, lisosomi, mitocondri, e il citoscheletro di actina.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, l'avvento della microscopia diretta e l'uso di proteine ​​fluorescenti hanno portato a importanti progressi in ogni processo cellulare immaginabile, facendo progredire la nostra comprensione della biologia cellulare ^1. Questo campo ha beneficiato enormemente dall'utilizzo di colture di cellule di mammiferi che sono estremamente potenti sistemi modello, in particolare quando si tratta di manipolazioni sperimentali. Tuttavia, essi spesso non forniscono una rappresentazione fedele della biologia dei complessi organismi pluricellulari ^2. Questo problema ha cominciato ad essere affrontati con lo sviluppo della microscopia intravitale (IVM), che ha aperto la porta ad indagare principali questioni biologiche in campi quali la neurobiologia, immunologia e biologia del tumore ^3. Finora, la maggior parte degli studi basati su IVM sono state eseguite a livello dei tessuti e cellule individuali, senza fornire alcuna informazione circa la dinamica dei compartimenti subcellulari. Recentemente, il nostro laboratorio e altris hanno sviluppato tecniche di IVM capaci di immagini strutture subcellulari nei roditori vivi ^{4-7, 13-15} e permettendo manipolazioni farmacologiche e genetiche in vivo. Questo approccio è stato utilizzato da noi per studiare il traffico di membrana in vivo, e più specificamente endocitosi e esocitosi regolata ^6,7.

Il nostro sistema modello sperimentale si basa sull'esposizione, la stabilizzazione e l'imaging delle ghiandole salivari sottomandibolare (SGS) di roditori anestetizzati. La scelta del SGs come modello organo per IVM è dovuto al fatto che le ghiandole sono facilmente accessibili eseguendo una chirurgia minore, può essere esteriorizzato senza compromettere la loro fisiologia, e stabilizzato per ridurre gli artefatti da movimento dovuti il ​​battito cardiaco e la respirazione. Inoltre, SGS è selettivamente manipolato geneticamente iniettando vettori basati sia virali o non virali attraverso il condotto salivare ^8,9. Infine, SGS sono ghiandole esocrine composte epith polarizzataElial cellule, che formano acini e dotti, cellule mioepiteliali, e conta complesso di cellule stromali. Per questa ragione, sono un ottimo modello per studiare esocitosi, endocitosi, la consegna del gene, e citoscheletro di actina, come evidenziato nei nostri recenti studi ^10, e di offrire l'opportunità di studiare aspetti della biologia cellulare come polarità cellulare, divisione cellulare, cellula- giunzioni cellulari e canali ionici.

In questo lavoro descriviamo in dettaglio un protocollo di imaging per il raggiungimento di risoluzione subcellulare nell'epitelio delle SG di un topo vivo. In particolare, mostriamo come immagine granuli di secrezione nelle cellule acinose del SG durante esocitosi regolata. Come precedentemente indicato, dopo stimolazione con agonisti del recettore beta-adrenergico, granuli secretori fondono con la membrana plasmatica apicale e gradualmente collassano, rilasciando il loro contenuto nel canalicoli acinose ^6. Il nostro obiettivo è quello di fornire gli strumenti di base per gli investigatori con mesperienza inimal nelle procedure chirurgiche e di trattamento degli animali, in modo da poter eseguire con successo IVM ad una risoluzione subcellulare. Poiché la parte più impegnativa in IVM è la preparazione dell'animale, qui ci concentriamo sulla descrizione delle procedure chirurgiche di base che sono utilizzati per esporre e immobilizzare SGS senza compromettere la loro funzione. Per quanto riguarda le procedure di etichettare strutture subcellulari, diverse strategie, come la distribuzione sistemica di sonde fluorescenti, impiego di animali transgenici, o una combinazione di entrambi, sono state descritte altrove ^7,11.

Protocollo

Parte 1: Microscopio e Preparazione del Setup Imaging

1. Qualsiasi microscopio confocale invertito dovrebbe essere adatto per IVM. In questo studio è stato usato un microscopio Olympus IX81 invertito, dotato di una unità di scansione laser confocale FluoView-1000. Per ottenere la migliore risoluzione possibile, si raccomanda l'uso di obiettivi alti NA, come l'acqua-immersion UPLSAPO 60x/1.20 NA, e l'immersione olio Plan-Apo 60x/1.42 NA. Obiettivi ad immersione olio hanno efficienze di raccolta più elevati e anche se richiedono l'uso di un coprioggetto tra il tessuto e l'obiettivo, prevedono la migliore qualità dell'immagine quando impiegati in aree dell'immagine entro 15-20 micron dalla superficie. Inoltre, l'uso di olio elimina la preoccupazione per l'evaporazione dell'acqua durante le sessioni di imaging più lunghi. Al fine di mantenere la temperatura e l'umidità, il microscopio deve essere completamente chiusa e alimentato con aria calda e umidificata. In alternativa, l'animale, la fase di microscopio, e laobiettivo deve essere riscaldato con altri mezzi. Ad esempio, pastiglie di calore chimica possono essere utilizzati per l'animale e la fase, e riscaldatori oggettivi specificamente progettati possono essere utilizzati per l'obiettivo (Figura 1A). Il riscaldatore obiettivo deve essere acceso 30 min prima di iniziare la procedura. Nota: quando le pastiglie di calore sono utilizzati per mantenere l'animale caldo una garza deve posizionare tra il pad e la pelle. La pelle deve essere monitorato per le ustioni.
2. Le fasi standard nella maggior parte dei microscopi confocali disponibili in commercio hanno un'apertura che è utilizzata per inserire diversi supporti che vengono utilizzati per adattarsi diapositive, capsule Petri e piastre di dimensioni diverse. Per eseguire IVM, un inserto standard stadio 35 mm piastre Petri è invertita capovolta, coperto con un vetrino 40 mm, che viene poi fissato con grasso alto vuoto silicone o nastro adesivo (Figura 1A). Un inserto personalizzato può anche essere fabbricato a partire da 3 millimetri piastra in alluminio di spessore. La superficie di vetro è poi cleaned con 70% etanolo e strisciato con un Kimwipe.
3. Fabbricazione un supporto personalizzato per l'immobilizzazione SGS (stabilizzatore). Lo scopo del supporto è di stabilizzare SGS in atto e rigidamente loro coppia sul palco e il vetrino. Il supporto può essere costituito da una piastra di Petri 60 millimetri di plastica. In primo luogo, il fondo del piatto è rotto lontano dalle pareti e tagliato in rettangoli di circa 15 x 10 mm. Poi, i bordi sono arrotondati e lucidati utilizzando carta vetrata fine. Quattro distanziatori (1,5-2 mm) sono costruiti togliendo la punta in gomma di 1 ml stantuffi delle siringhe. Utilizzando carta vetrata fine, la superficie dei distanziatori ei quattro angoli del pezzo di plastica sono lucidate. I distanziali sono poi incollati mediante colla gelatinosa, e poi lisciato con carta vetrata fine su una superficie piana. Si noti, che per animali più vecchi, la dimensione dei supporti ed i distanziatori possono dover essere aumentato per tener ghiandole leggermente più grandi.
4. Preparazione del gel di accoppiamento ottico. 0,3% Carbomer-940 (Tabella 2) gel viene preparato mediante riscaldamento 100 ml di acqua ultra-pura e sciogliendo 5,47 g di D-sorbitolo. Poi, si aggiungono 0,3 g di Carbomer-940. Il bicchiere deve essere coperto e collocato su una piastra di agitazione (impostazione più caldo) per diverse ore o fino a quando tutti i grumi carbomer sono completamente sciolto. Infine, Trietanolamine viene aggiunto goccia a goccia agitando moderatamente, fino a raggiungere un pH di circa 7,4. Il gel viene conservato a 4 ° C ^13.

Parte 2: Animali ed Anestesia

1. Prima di eseguire eventuali esperimenti con gli animali, i protocolli dovrebbero essere approvati dalla vostra cura degli animali e comitato etico locale. È importante sottolineare che i ricercatori dovrebbero essere adeguatamente formati per eseguire le procedure chirurgiche e dovrebbero consultare il proprio comitato di cura degli animali locale o istituto veterinario prima di procedere con la procedura.
2. In questo studio, un modello murino (GFP / mTomato-mouse) derivato dall'incrocio topi FVB che esprimono GFP solubile (GFP-mouse) with topi C57B6 esprimono un peptide membrana mirati fusa con la proteina fluorescente tandem-pomodoro (mTomato-mouse) ⁶ è stato utilizzato. Nota: prende solitamente 20-30 minuti per l'animale a diventare completamente anestetizzato e predisposto per l'imaging
3. I topi sono alloggiati in un ambiente controllato nella struttura animale e possono acclimatare per una settimana prima dell'esperimento. Questo passaggio è necessario per l'imaging SGS dato alcun risultato soccorso in una maggiore attività secretoria ^12. Acqua e cibo sono forniti ad libitum. I maschi di 2 -5 mesi verranno usati per esperimenti di imaging (20-30 g).
4. Prima dell'anestesia, pesare gli animali per stabilire il corretto dosaggio di anestetico.
5. Poiché lo stress indotto dalla somministrazione di anestetici iniettabili può compromettere l'attività secretoria della SGS, indurre pre-anestesia per inalazione isoflurano, seguito dall'iniezione di anestetici. A tale scopo, posizionare i topi molto delicatamente nella camera di vaporizzazione, eattivare il flusso di ossigeno (800-900 mmHg). Impostare i livelli di isoflurano al 3% per iniziare l'induzione pre-anestesia.
6. Una volta che gli animali sono inconscia, iniettare una miscela di 100 mg / kg di ketamina e 20 mg / kg xilazina nella cavità peritoneale (25 ago G). Anestetici sono preparati diluendo 100 mg / xilazina ml a 20 mg / ml in soluzione salina e poi mescolandolo con la ketamina. Questa miscela viene ulteriormente diluito 1:1 con soluzione salina e una quantità appropriata viene iniettata in base al peso animale. Questa diluizione aiuta a prevenire sovradosaggio accidentale. Si noti che la miscela perde la sua efficacia dopo 20 min.
7. Osservare gli animali per i segni di veglia e di iniettare la miscela più di anestetico se stanno venendo fuori di anestesia (circa il 75% della dose iniziale entro 45 minuti dopo la prima iniezione, e il 50% ogni ora successiva). Controllare la profondità dell'anestesia ogni 15 min premendo la zampa e osservando la risposta. Nota: somministrare sempre pomata oftalmica per preveniresecchezza oculare.
8. Anestetici indurre ipotermia, che può condizionare la riproducibilità degli esperimenti e la salute dell'animale. Pertanto, i topi devono essere tenuti sotto la lampada di calore o su un tappetino riscaldato per tutta la durata dell'esperimento. Nota: la lampada di calore deve essere di almeno 12-18 centimetri dalla animale per prevenire la combustione
9. La temperatura corporea degli animali deve essere controllata con un termometro dotato di sonda temperatura rettale.

Parte 3: Chirurgia animali e Posizionamento per intravitale Microscopia

1. Preparare l'area di lavoro con tutti gli strumenti chirurgici (Tabella 1) che dovrebbero essere pulito e sterile.
2. Radere la zona del collo del mouse con un tagliatore elettrico. Pulire la faccia ventrale del collo del mouse anestetizzato con una garza imbevuta di etanolo al 70%. Asciugare l'eccesso con un Kimwipe.
3. Con pinzette ricurve sordo sollevare un piccolo pezzo di pelle sulla linea mediana (ravvicinavallo all'estremità inferiore dei muscoli massetere), e fare una piccola incisione (Figura 1B).
4. Inserire le forbici nell'apertura e separare la pelle dal tessuto sottostante aprendo le lame delle forbici. Evitare di danneggiare il tessuto ghiandolare sottostante indicando le forbici verso la parte inferiore della pelle. Ripetere questa operazione più volte fino a quando la pelle viene separato dai tessuti più profondi (Figura 1B).
5. Utilizzando le forbici, tagliare una striscia di pelle allentata di circa 3 mm e 10 mm di lunghezza. La pelle deve essere tagliato in modo che l'apertura inizia vicino alla base del SGS dove il nervo, il condotto e vasi sanguigni collegano la ghiandola al resto del corpo. Dopo aver pulito la superficie della ferita, l'apertura risultante sarà di forma ovale e misura circa 8 x 12 mm. Entrambi SG saranno visibili dopo l'apertura (Figura 1B).
6. Con una siringa applicare il gel di accoppiamento ottico nel mezzo del taglio e pulirlo versol'esterno con garza sterile. Pezzi puliti di garza devono essere utilizzati per ogni spazzolata per evitare l'introduzione di capelli o sangue nel tessuto esposto. Ripetere questa operazione fino a quando tutti i capelli sciolti e il sangue viene rimosso.
7. Utilizzando # 7 pinzette, separare il tessuto connettivo dalla ghiandola sottomandibolare destra fino alla base della ghiandola (in alternativa questo protocollo può essere utilizzato su SGS sinistra). In primo luogo, trovare la punta del SG e afferrare il tessuto connettivo pochi millimetri sopra la punta della ghiandola. Strappare il tessuto connettivo intorno alla ghiandola senza ferire il parenchima. (Figura 1B). Una volta che la ghiandola è esposto, separare delicatamente il tessuto connettivo dalla ghiandola. Se si verifica sanguinamento, lavare via il sangue con soluzione fisiologica. Assicurarsi che tutti i tessuti connettivi vengono separati e la ghiandola è completamente esposti. Mantenere la ghiandola umido applicando gel accoppiamento ottico regolarmente.
8. Prima di portare l'animale al microscopio, mettere un grosso pezzo di garza e heat imballare sul palco microscopio per mantenere una temperatura di 38 ± 2 ° C. La temperatura del pacco di calore chimica può essere regolata dalla dimensione dei tagli che espongono il sacchetto interno all'atmosfera. Garza fornisce alcune isolamento del pacco di calore dalla fase metallica. Coprire la parte superiore del pacco di calore con un pezzo sottile di garza pure.
9. Posto l'animale sul lato (lato destro per la ghiandola destra) e sulla garza. Posizionare l'animale con la ghiandola salivare sottomandibolare posta al centro del vetrino (Figura 1C).
10. L'animale deve essere fissato e stabilizzato in questa posizione prima immobilizzare ghiandola. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sul lato ventrale della zampa anteriore destro del mouse. Agganciare gli incisivi del mouse da una sutura di seta (Figura 1C, nel riquadro). Creare qualche tensione tra il filo di seta e la zampa e fissarle sul palco da nastro adesivo. Il SG deve essere appoggiato naturalmente nel mezzo dellacoprioggetto. La testa e il torace devono essere ulteriormente stabilizzata da cunei di plastica che possono essere accoppiati alla fase.
11. Mettere un piccolo pezzo di pulizia dell'obiettivo tessuto sopra la ghiandola (Figura 1C). Estendere la ghiandola leggermente e inserire un supporto personalizzato sulla ghiandola. Strettamente coppia lo stabilizzatore sul palco con nastro adesivo. Accoppiamento può essere migliorata con una fascetta metallica collegata alla fase (Figura 1C). Angoli tensione e taglienti dovrebbero essere evitati in quanto possono compromettere il flusso di sangue. Subito dopo la stabilizzazione controllare il flusso di sangue sia esaminando visivamente ghiandola (dovrebbe mantenere colorazione rosa) o da epifluorescenza. Nel topo GFP / m-pomodoro, alterazioni lordo del flusso sanguigno può essere facilmente valutati dal momento che entrambi i vasi sanguigni e molte delle cellule del sangue sono etichettati con il m-pomodoro.
12. Coprire l'animale con una garza e un pad riscaldato. Misurare la temperatura della ghiandola esposto usando un termometro attrezzata won una piccola sonda a termocoppia flessibile posto a contatto con un lato della ghiandola esposta.

Parte 4: parametri di imaging

1. Uso epifluorescenza illuminazione fuoco sulla superficie della ghiandola sia usando il GFP o il set di filtri RFP. Trova superficie della SG, e valutare il flusso di sangue nei capillari e la morfologia complessiva del tessuto. Segni di danno tissutale includono membrana blebbing o la comparsa di grandi vacuoli.
2. Valutare la stabilità del tessuto sia tramite epifluorescenza o pre-scansione dell'area selezionata. Una preparazione stabile è essenziale, dal momento che la maggior parte degli artefatti da movimento non possano essere rimossi o corretti per l'analisi dei dati di post-elaborazione. Se la preparazione non è stabile, sono necessari aggiustamenti.
3. Per trovare l'immagine piano focale adeguata le ghiandole in modalità pre-scansione (1X zoom), e spostare progressivamente l'obiettivo verso il vetrino fino a quando le strutture acinose, i granuli di secreto e il pmembrana Lasma diventa chiaramente visibile (Figura 2).
4. I parametri di imaging per il time-lapse dipendono dal singolo esperimento. All'immagine della dinamica dei granuli secretori utilizzano una velocità di scansione di 0,5-2 sec / frame e 256 x 256 pixel con una scala spaziale 0,2 micron / pixel (campo visivo di circa 50 um x 50 um). Per la visualizzazione ottimale dei granuli e la membrana plasmatica, lo spessore ottico va posizionato tra 0,9-1,2 micron. Per eccitare la GFP e la tandem-pomodoro, si può utilizzare una lunghezza d'onda di 488 nm e 561 nm, rispettivamente. La potenza di picco è impostato circa 0,5 mW per la 488 nm e 1 mW per il 561 nm. Questo assicura photobleaching minimo.
5. Le impostazioni del rivelatore devono essere regolati per mantenere il segnale entro la gamma dinamica e dipende dalla luminosità del campione.
6. Una volta che tutti i parametri sono impostati, imaging può essere avviato. In primo luogo, prendere un'istantanea del campo di vista per essere utilizzato come punto di riferimento. Mentreimaging time lapse, può verificarsi deriva del tessuto in XY e Z. Questo può essere compensato manualmente regolando l'area di scansione e la posizione Z. Gli adeguamenti devono essere effettuati gradualmente e da piccoli incrementi per evitare artefatti. Inoltre, l'immagine di riferimento può essere utilizzato per determinare se si verifica fotoscolorimento. Se significativo fotoscolorimento viene rilevato (riduzione maggiore del 15-20% in fluorescenza), ridurre la potenza del laser di 0,1 mW.
7. Per stimolare esocitosi, un'iniezione sottocutanea di 0,1 mg / kg di una soluzione preparata di isoproterenolo in soluzione salina. Esocitosi viene attivato circa 1 minuto dopo l'iniezione. Granuli secretori di fusione con la membrana plasmatica saranno rilevati da un aumento di fluorescenza GFP attorno ai granuli e la diffusione dei peptidi tandem-pomodoro nelle loro membrane limitanti (Figura 3). Si consiglia di acquisire 3-4 sequenze time-lapse nella stessa zona, 10 min ciascuno.
8. Dopo la sessione di imaging, eutanasia l'anesthetized animale da CO ₂ inalazione in una camera di eutanasia (10-12 mmHg per 10 min).

Risultati

Nel topo GFP / mTomato, gli acini appaiono come strutture ben distinte, che esprimono GFP citosolica e di membrana mirati tandem-pomodoro peptide (Figura 2, linea tratteggiata). In acini individuo, le cellule acinose sono delineati dal peptide tandem-pomodoro. GFP è rilevata anche nei nuclei che sono chiaramente visibili all'interno delle cellule acinose (Figura 2, frecce). GFP citosolico viene escluso dai granuli di secreto che appaiono vescicole circolari scure di circa 1-1.5 mic...

Discussione

Finora strutture cellulari sono stati in gran parte ripreso in vitro (cioè colture cellulari) o ex vivo (cioè organo-culture, fette di tessuto, preparazioni acinose) sistemi modello che spesso non ricapitolano le caratteristiche del intatti tessuti vivi ^6. A tale riguardo, l'approccio qui presentato rappresenta un importante passo avanti in quanto consente imaging delle dinamiche di una determinata tratta passo membrana (esocitosi cioè regolata) in topi vivente.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B	Bausch and Lomb	24208-785-55	Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279	Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)	Braintree Scientific	190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter	Hazard Technology	PDDT
Heat lamp, Model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer	Braintree Scientific	TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight	World Precision Instruments	5003708-12
#7 curved tip tweezers	World Precision Instruments	14187
Microscissors	World Precision Instruments	503365
Black Braided Silk suture #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gauze sponges 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Lens cleaning tissue	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476