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Resumo

A caracol marinha Aplysia californica tem sido amplamente utilizada como modelo de neurobiologia para os estudos sobre base celular e molecular do comportamento. Aqui é descrita uma metodologia para explorar o sistema nervoso da Aplysia para as análises eletrofisiológicas e moleculares de neurônios únicos de circuitos neurais identificados.

Resumo

Um grande desafio na neurobiologia é entender os fundamentos moleculares dos circuitos neurais que governam um comportamento específico. Uma vez identificados os mecanismos moleculares específicos, novas estratégias terapêuticas podem ser desenvolvidas para tratar anormalidades em comportamentos específicos causados por doenças degenerativas ou envelhecimento do sistema nervoso. O caracol marinho Aplysia californica é adequado para as investigações de base celular e molecular do comportamento porque circuitos neurais subjacentes a um comportamento específico poderiam ser facilmente determinados e os componentes individuais do circuito poderiam ser facilmente manipulados. Essas vantagens da Aplísia levaram a várias descobertas fundamentais da neurobiologia da aprendizagem e da memória. Aqui descrevemos uma preparação do sistema nervoso da Aplysia para as análises eletrofisiológicas e moleculares dos neurônios individuais. Resumidamente, o gânglio dissecado do sistema nervoso é exposto à protease para remover a baia de gânglio, de modo que os neurônios sejam expostos, mas retenham a atividade neuronal como no animal intacto. Esta preparação é usada para realizar medições eletrofisiológicas de neurônios únicos ou múltiplos. É importante ressaltar que, após o registro utilizando uma metodologia simples, os neurônios poderiam ser isolados diretamente dos gânglios para análise de expressão genética. Esses protocolos foram utilizados para realizar gravações eletrofisiológicas simultâneas de neurônios L7 e R15, estudar sua resposta à acetilcolina e à expressão quantitante do gene CREB1 em neurônios isolados L7, L11, R15 e R2 da Aplysia.

Introdução

O cérebro humano é extraordinariamente complexo com quase 100 bilhões de neurônios e trilhões de conexões sinápticas. Há quase um número igual de células nonneuronas que interagem com neurônios e regulam sua função no cérebro. Os neurônios são organizados em circuitos que regulam comportamentos específicos. Apesar dos avanços em nossa compreensão das funções cerebrais e circuitos neurais, pouco se sabe sobre a identidade dos componentes dos circuitos que controlam um comportamento específico. O conhecimento das identidades de vários componentes de um circuito facilitará muito nossa compreensão da base celular e molecular do comportamento e ajudará no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para distúrbios neuropsiquiátricos.

O caracol marinho Aplysia californica tem sido um cavalo de trabalho para determinar circuitos neuronais subjacentes a comportamentos específicos1-14. O sistema nervoso da Aplysia contém aproximadamente 20.000 neurônios que são organizados em 9 gânglios diferentes. Os neurônios da Aplísia são grandes e podem ser facilmente identificados com base em seu tamanho, propriedades elétricas e posição no gânglio. A Aplysia tem um rico repertório de comportamentos que podem ser estudados. Um dos comportamentos bem estudados é o reflexo de retirada de brânquias (GWR). Os componentes centrais deste reflexo estão situados em gânglios abdominais. Componentes do circuito GWR foram mapeados e contribuições de vários componentes determinados. É importante ressaltar que o circuito GWR sofre aprendizado associativo e não associativo5,6,15-19. Décadas de estudo sobre esse reflexo também identificaram diversas vias de sinalização que têm um papel fundamental na aprendizagem e na memória20-24.

Várias preparações diferentes da Aplysia foram usadas para estudar base celular e molecular do armazenamento de memória. Estes incluem o animal intacto2,3, preparação semi-intacta1,7,13,14,16 e reconstituição dos principais componentes do circuito neural25-29. Uma preparação reduzida para explorar a Aplysia gânglios para as análises eletrofisiológicas e moleculares de circuitos neuronais identificados é descrita aqui. Foram estudados os quatro neurônios identificados a seguir. R15, um neurônio estourando, L7 e L11, dois neurônios motores diferentes e R2, um neurônio colinérgico foram estudados. R2 é o maior neurônio descrito no sistema nervoso invertebrado. Resumidamente, essa metodologia envolve o tratamento protease de gânglios, medidas eletrofisiológicas antes e depois de tratamentos farmacológicos e isolamento de neurônios únicos para análise quantitativa da expressão genética. Essa metodologia nos permite combinar análises moleculares com gravação simultânea de múltiplos neurônios. Esta metodologia foi utilizada com sucesso para estudar respostas de neurônios R15 e L7 à acetilcolina (Ach) por gravações intracelulares emparelhadas. Após medições eletrofisiológicas R15 e L7 e outros neurônios identificados como L11 e R2 foram isolados para análise quantitativa da reação em cadeia de polimerase (qPCR) da expressão do CREB1, fator de transcrição importante para o armazenamento da memória.

Protocolo

1. Preparação de Gânglios Abdominais, Medidas Eletrofisiológicas e Isolamento de Neurônios Identificados Únicos do Gânglio Abdominal da Aplysia californica

  1. Mantenha a Aplysia no aquário de laboratório com água do mar artificial circulante (ASW) a 16 °C sob 12:12 claras:condições escuras.
  2. Isolamento do gânglio abdominal.
    1. Anestesiar animais injetando 380 mM MgCl2 solução por 5-10 min (equivalente a 30-35% do peso corporal do animal).
    2. Identificar o gânglio abdominal com base em sua posição no sistema nervoso central24,28.
    3. Remova o gânglio por operação cirúrgica e armazene imediatamente em água do mar artificial composta por 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3e 10 mM HEPES (pH 7.4).
  3. Tratamento protease.
    1. Incubar o gânglio abdominal por 30 min a 34 °C±0,5 em uma placa de Petri com 0,1% de protease (dispase) diluída em ASW descrita acima.
      NOTA: A quantidade da protease utilizada precisa ser padronizada com a idade e o peso dos animais. Em geral, animais mais velhos e maiores exigiriam mais protease.
  4. Remoção da baia de gânglio.
    1. Após o tratamento enzimante, fixe o gânglio na base de silicone sylgard de uma câmara celular (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e perfuse com ASW (taxa de fluxo: 150 μl/min) à temperatura ambiente (18 °C±2 ).
      NOTA: Para aumentar a visibilidade dos neurônios identificados, coloque o gânglio na parte superior de um cilindro de vidro de policarbonato(Figura 1) (diâmetro Ø= câmara celular modificada de 2 mm) que pode ser facilmente iluminado a partir da parte inferior usando um estereómico binóculo com ampliação de 20X e 40X.
    2. Remova cuidadosamente a bainha do gânglio usando fórceps e microscisores.
  5. Gravação eletrofisiológica simultânea de dois neurônios.
    1. Identifique neurônio de interesse.
    2. Empalear o neurônio com uma única microeletrância afiada intracelular com resistência de 10-15 MΩ preenchida com solução de 3 M KCl.
    3. Registre a atividade neuronal (passe de banda de 10 kHz) usando um sistema de gravação intracelular.
    4. Processe os dados de gravação usando softwares de eletrofisiologia, como o Axograph.
      NOTA: Pode-se facilmente realizar a gravação de múltiplos neurônios. Os neurônios L7, L11 ou R15 e R2 são facilmente identificados com base em sua posição. Dois amplificadores e dois micromanipuladores são necessários para o registro simultanea de dois neurônios L7 e R15(Figura 2).
  6. Aplicação de drogas.
    1. Aplique a droga de escolha na câmara celular por tubulação suave ou injete diretamente nos neurônios.
    2. Realizar medições eletrofisiológicas.
      NOTA: Dependendo do objetivo experimental, pode-se medir diferentes parâmetros eletrofisiológicos de neurônios, como as alterações no potencial de membrana (MP) ou potencial de ação (AP) antes, durante e depois da aplicação da droga.
  7. Isolamento de neurônios únicos.
    1. Ao final dos experimentos eletrofisiológicos, pare a perfusão do ASW e lave o gânglio com 100% de etanol.  A exposição ao etanol petrificará os neurônios e, usando fórceps finos, facilitará a remoção de neurônios individuais sem danificar outros neurônios do gânglio.
    2. Remova neurônios únicos sob um estereótipo e transfira para um pequeno tubo Eppendorf contendo reagente de extração de RNA gelado de 500 μl. Neurônios únicos isolados podem ser armazenados no reagente de extração de RNA a -80 °C para análise futura.

2. Isolamento de RNA de neurônios únicos e análise de expressão genética por PCR em tempo real quantitativo (qPCR)

  1. Precauções para minimizar a degradação do RNA:
    As ribonucleases (RNases) degradam o RNA e são enzimas muito estáveis e ativas. Tome as seguintes etapas durante o manuseio de RNAs.
    1. Limpe a área de trabalho e os instrumentos com agentes desativadores da RNase.
    2. Use luvas o tempo todo enquanto manuseia RNA e troque as luvas com frequência.
    3. Use apenas plásticos livres RNase para lidar com RNAs.
  2. Isolando o RNA total de neurônios únicos:
    1. O protocolo Trizol padrão para isolamento de RNA pode ser usado para isolar RNAs de neurônios únicos. Adicione brevemente 20% v/v de clorofórmio ao Trizol, misture bem por um breve vórtice.
    2. Coloque os tubos no rotador por 10 min a 4 °C. Gire a mistura Trizol-Cloroforme a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
    3. Pegue a fase aquosa e transfira para um tubo fresco.
    4. Adicione a solução de acetato de sódio (pH 5.5) a uma concentração final de 0,3 M, 100 ng/ml do coprecipitante GlycoBlue, e 2,5 volumes de 100% de etanol para precipitar RNA.
    5. Misture bem as amostras e incubar a -80 °C durante a noite.
    6. Gire as amostras a 12.000 x g por 20 min a 4 °C e uma pequena pelota azul será visível na parte inferior do tubo.
    7. Retire o supernasce e lave a pelota com 850 μl de 75% de etanol gelado a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
    8. Remova o supernatante cuidadosamente e seque a pelota de RNA por 7-10 min, no máximo.
      NOTA: Certifique-se de que o RNA não é deixado por muito tempo para secar como mais-a secagem da pelota de RNA torna a solubilização muito difícil.
    9. Uma vez seco, resuspenque a pelota de RNA em 10 μl de água livre RNAse e determine a concentração de RNA.
      NOTA: Determine a concentração de RNA usando um espectotômetro. Quando não estiver usando imediatamente, armazene o RNA a -80 °C.
  3. síntese de aRNA de neurônios únicos:
    1. Amplie o RNA (uma ou duas rodadas dependendo do objetivo experimental) usando sistema de amplificação linear de RNA comercialmente disponível.
      NOTA: O RNA total de neurônios únicos variou de ~10-60 ng. O rendimento esperado da primeira rodada de amplificação é de ~100-300 ng e a segunda rodada de amplificação é ~0,8-1,5 μg de RNA.
  4. Transcrição reversa do RNA:
    1. Para gerar cDNA a partir de aRNA, use 1,0 μg de aRNA em 20 μl de uma reação de transcrição reversa. Vários kits estão disponíveis comercialmente para este fim.

      NOTA: o cDNA foi sintetizado de acordo com o protocolo do fabricante usando as seguintes configurações no cicloviário térmico.
      5 min a 25 °C
      30 min a 42 °C
      5 min a 85 °C
      Mantenha a 4 °C
    2. Após a etapa de transcrição reversa, armazene o cDNA a -20 °C para armazenamento a longo prazo.
  5. Design e padronização do primer:
    Vários excelentes programas de software estão disponíveis, gratuitamente, para projetar primers para amplificações em tempo real.
    1. Selecione 18-24 mer oligonucleotídeos que produzem amplicons de 70-110 bp e sintetize os primers usando fontes comerciais.
      NOTA: Dois a três pares de primer devem ser projetados para cada gene de interesse. Cada conjunto de primer precisa ser padronizado por qPCR. Os pares de primer dianteiro e reverso que foram usados para gene CREB1 (Figura 4) estão abaixo:

      Conjunto de primer 1
      Atacante: 5'TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3'
      Reverso: 5'-ACCGTGAGCAGAGAGTTGTAGA-3'
      Conjunto de primer 2
      Atacante: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3'

      Reverso: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAA-3'
    2. Para selecionar o melhor primer a ser usado para as análises a jusante, monitore o valor do TC e a forma da curva de amplificação em qPCR.
      NOTA: Os primers que dão valores ct (limiar de ciclo) entre 10-35 na amplificação redonda de 40 rodadas e curvas suaves durante a fase exponencial do PCR seguido de um platô liso são ideais para análises de expressão genética.
  6. PCR em tempo real quantitativo (qPCR):
    Nota: Utilize tubos ou placas apropriados compatíveis com a máquina qPCR.
    1. Diluir cDNA para 5x com água livre de nuclease.
    2. A 2 μl de cDNA diluído, adicione 8 μl de uma mistura mestre qPCR contendo 2 μl de H2O, 5 μl de 2x SYBR Green master mix e 1,0 μl de 10 μM (cada) primer para frente e reverso.
    3. Feche os tubos e sele a placa após a pipetação cDNA e a mistura mestre. Misture o conteúdo tocando suavemente e girando a 1.500 rpm por 30 segundos.
    4. Prossiga para a configuração da máquina qPCR.

Resultados

Os pesos dos animais utilizados neste estudo variaram de 100 a 200 g. Seguindo os protocolos descritos, realizamos medições eletrofisiológicas e análise molecular de neurônios de gânglios abdominais isolados de animais que variam de 2-5 g a 200-300 g.

A padronização do tratamento protease é importante para medições eletrofisiológicas bem sucedidas de neurônios nos gânglios. Inicialmente, foram utilizadas concentrações e durações de protease múltipla (Dispase) e potenciais de...

Discussão

O neurônio R15 está envolvido na regulação dos sistemas cardiovascular, digestivo, respiratório e reprodutivo30. Uma atividade de estouro regularmente rítmico do AP é uma característica do R15. Como mostrado na seção de resultados, a gravação emparelhada de R15 e L7 mostra que a preparação de gânglios preservou a atividade dos neurônios R15. Os neurônios R15 e L7 responderam apropriadamente ao Ach. Esta preparação de gânglios poderia ser mantida até 8-10 horas e a atividade eletrofisiológ...

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente à Fundação Whitehall por seu apoio ao financiamento e fundos de startup do Scripps Research Institute para a realização deste trabalho.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
Nuclease free waterAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
ForcepsFine Science Tools11252-20
ScissorsFine Science Tools15000-08
Stainless Steel Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R CentrifugeEppendorf5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR
AmplifierBRAMP-01RNPI Electronics
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Micro ManipulatorPatch StarScientifica

Referências

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