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요약

해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

초록

신경생물학의 주요 과제는 특정 행동을 지배하는 신경 회로의 분자 기초를 이해하는 것입니다. 특정 분자 메커니즘이 확인되면 퇴행성 질환이나 신경계 노화로 인한 특정 행동의 이상을 치료하기 위해 새로운 치료 전략을 개발할 수 있습니다. 해양 달팽이 Aplysia californica는 특정 행동의 근본적인 신경 회로가 쉽게 결정될 수 있고 회로의 개별 적인 분대가 쉽게 조작될 수 있기 때문에 행동의 세포 및 분자 기초의 조사에 적합합니다. Aplysia의 이러한 장점은 학습과 기억의 신경 생물학의 몇 가지 근본적인 발견으로 이어졌습니다. 여기에서 우리는 개별 적인 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia 신경계의 준비를 기술합니다. 간단히, 신경계에서 해부된 신경절은 신경세포가 노출되나 그대로 동물에서와 같이 신경 활성을 유지하도록 신경절 칼집을 제거하기 위해 프로테아제스에 노출된다. 이 준비는 단일 또는 다중 뉴런의 전기 생리학적 측정을 수행하는 데 사용됩니다. 중요한 것은, 간단한 방법론을 사용하여 기록을 따라, 뉴런은 유전자 발현 분석을 위해 신경질로부터 직접 분리될 수 있었다. 이러한 프로토콜은 L7 및 R15 뉴런으로부터 동시 전기 생리학적 기록을 수행하고, 아세틸콜린에 대한 반응과 분리된 단일 L7, L11, R15 및 Aplysia의R2 뉴런에서 CREB1 유전자의 양화 발현을 연구하는 데 사용되었습니다.

서문

인간의 뇌는 거의 1,000억 개의 뉴런과 수조 개의 시냅스 연결로 매우 복잡합니다. 뉴런과 상호 작용하고 뇌에서 의 기능을 조절하는 비 신경 세포의 거의 동일한 수가 있습니다. 뉴런은 특정 행동을 조절하는 회로로 구성됩니다. 뇌 기능 및 신경 회로에 대한 이해의 발전에도 불구하고 특정 동작을 제어하는 회로 구성 요소의 정체성에 대해서는 알려진 것이 거의 없습니다. 회로의 다양한 구성 요소의 정체성에 대한 지식은 크게 행동의 세포 및 분자 기초의 우리의 이해를 용이하게하고 신경 정신 장애에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이.

해양 달팽이 Aplysia californica는 특정 행동1-14의근본적인 신경 회로를 결정하기위한 주력이었다. Aplysia 신경계는 9개의 다른 신경통으로 조직되는 대략 20,000의 신경세포를 포함합니다. Aplysia의 뉴런은 크고 그들의 크기, 전기 적 특성 및 신경리아의 위치에 따라 쉽게 식별 할 수 있습니다. Aplysia는 연구할 수 있는 행동의 풍부한 레퍼토리가 있습니다. 잘 연구 된 행동 중 하나는 아가미 철수 반사 (GWR)입니다. 이 반사의 중앙 구성 요소는 복부 신경통에 위치하고 있습니다. GWR 회로의 구성 요소가 매핑되고 다양한 구성 요소의 기여가 결정되었습니다. 중요한 것은, GWR 회로는 연관 및 비연관적 학습5,6,15-19를겪는다. 이 반사에 대한 연구의 수십 년은 또한 학습및 기억20-24에중요한 역할을 여러 신호 경로를 확인했다.

Aplysia의 몇몇 다른 준비는 기억 저장의 세포 그리고 분자 기초를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 여기에는 온전한 동물2,3,반전준비1,7,13,14,16 및 신경 회로의 주요 성분의재구성이 포함된다 25-29. 확인된 신경 회로의 전기 생리학적 및 분자 분석을 위한 Aplysia 신경리아를 탐구하기 위한 감소된 준비는 여기에서 기술됩니다. 다음 4 개의 확인 된 뉴런 을 공부 했다. R15, 파열 뉴런, L7 및 L11, 두 개의 다른 모터 뉴런과 R2, 콜린성 뉴런을 연구했다. R2는 무척추 동물 신경계에 설명 된 가장 큰 뉴런입니다. 간단히 말해서, 이 방법론은 신경리아의 프로테아제 치료, 약리학적 치료 전후의 전기 생리학적 측정, 유전자 발현의 정량적 분석을 위한 단일 뉴런의 분리를 포함합니다. 이 방법론은 분자 분석을 여러 뉴런의 동시 기록과 결합할 수 있게 해줍니다. 이 방법론은 성공적으로 쌍 세포 내 기록에 의해 아세틸 콜린 (Ach)에 R15 및 L7 뉴런의 응답을 연구하는 데 사용되었다. 전기생리학적 측정 에 이어 R15 및 L7 및 L11 및 R2와 같은 다른 확인된 뉴런은 메모리 저장에 중요한 전사 인크레B1의 발현의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 격리되었다.

프로토콜

1. 복 부 신경의 준비, 전기 생리 측정, 및 Aplysia californica의 복부 신경절에서 단일 식별 된 뉴런의 격리

  1. 12:12 빛:어두운 조건에서 16°C에서 인공 해수(ASW)를 순환하는 실험실 수족관에서 액량증을 유지합니다.
  2. 복부 신경절의 격리.
    1. 5-10 분 (동물의 체중의 30-35 %에 해당)에 대한 380 mM MgCl2 용액을 주입하여 동물을 마취.
    2. 중추 신경계의 위치에 따라 복부 신경절을 식별24,28.
    3. 외과수술에 의한 신경담을 제거하고 450mM NaCl, 10mM KCl, 10mM MKCl 2, 55mM MgCl2,2.5mM NaHCO3,10mM HEPES(pH 7.4)로 구성된 인공 해수에 즉시 보관한다.
  3. 프로테아제 치료.
    1. 상술한 ASW에서 희석된 0.1%의 프로테아제(dispase)를 가진 페트리 접시에서 34°C±0.5에서 30분 동안 복부 신경절을 배양한다.
      참고: 사용되는 프로테아제의 양은 동물의 나이와 무게로 표준화되어야 합니다. 일반적으로, 더 오래 되고 더 큰 동물은 더 많은 protease를 요구할 것입니다.
  4. 간리아 칼집의 제거.
    1. 효소 치료 후, 세포 챔버의 실가드 실리콘 베이스에 간리아를 고정 (Ø = 1cm; vol. = 0.3 ml) 실온에서 ASW (유량 : 150 μl/min) 실온 (18 °C±2).
      참고: 확인된 뉴런의 가시성을 높이기 위해, 20X 및 40X 배율을 가진 쌍안경 스테레오현미경을 사용하여 바닥에서 쉽게 발광할 수 있는 폴리카보네이트 유리 실린더(도1) (직경Ø= 2mm 변형 된 세포 챔버)의 상단에 신경절을 놓습니다.
    2. 집게와 미세 시저를 사용하여 신경절에서 칼집을 조심스럽게 제거합니다.
  5. 두 개의 뉴런에서 동시 전기 생리학적 기록.
    1. 관심의 뉴런을 식별합니다.
    2. 3 M KCl 용액으로 채워진 저항 10-15 MΩ으로 단일 세포 내 날카로운 마이크로 전극으로 뉴런을 임팔레.
    3. 셀룰러 내 레코딩 시스템을 사용하여 기록된 신경 활동(10kHz 대역 패스).
    4. 축사그래프와 같은 전기생리학 소프트웨어를 사용하여 기록 데이터를 처리합니다.
      참고: 여러 뉴런에서 녹음을 쉽게 수행할 수 있습니다. 뉴런 L7, L11 또는 R15 및 R2는 자신의 위치에 따라 쉽게 식별됩니다. 2개의 증폭기 및 2개의 마이크로조작기는 2개의 L7 및 R15 뉴런(그림2)에서동시에 기록하기 위해 요구됩니다.
  6. 약물 응용 프로그램.
    1. 부드러운 파이펫팅으로 셀 챔버에 선택의 약물을 적용하거나 뉴런에 직접 주입.
    2. 전기 생리학적 측정을 수행합니다.
      참고: 실험 목표에 따라 약물 적용 전, 도중 및 이후에 막 전위(MP) 또는 작용 잠재력(AP)의 변화와 같은 뉴런의 다른 전기생리학적 파라미터를 측정할 수 있습니다.
  7. 단일 뉴런의 격리.
    1. 전기 생리학적 실험이 끝나면 ASW의 관류를 중단하고 100% 에탄올로 신경절을 씻는다.  에탄올에 노출되면 뉴런이 석화되고 미세 포셉을 사용하여 신경절에서 다른 뉴런을 손상시키지 않고 개별 뉴런을 쉽게 제거할 수 있습니다.
    2. 스테레오현미경으로 단일 뉴런을 제거하고 얼음 감기 500 μl RNA 추출 시약을 포함하는 작은 Eppendorf 튜브로 이송하십시오. 고립 된 단일 뉴런은 향후 분석을 위해 -80 °C에서 RNA 추출 시약에 저장할 수 있습니다.

2. 정량적 실시간 PCR에 의한 단일 뉴런 및 유전자 발현 분석에서 RNA 절연(qPCR)

  1. RNA 분해를 최소화하기 위한 예방 조치:
    리보누알리스 (RNases)는 RNA를 저하시키고 매우 안정적이고 활성 효소입니다. RNA를 처리하는 동안 다음 단계를 수행합니다.
    1. RNase 비활성화 에이전트로 작업 영역과 계측기 청소.
    2. RNA를 취급하는 동안 항상 장갑을 착용하고 장갑을 자주 교체하십시오.
    3. RNA를 처리하기 위해 RNase 무료 플라스틱만 사용하십시오.
  2. 단일 뉴런에서 총 RNA를 격리:
    1. RNA 절연을 위한 표준 트리졸 프로토콜은 단 하나 뉴런에서 RNA를 격리하기 위하여 이용될 수 있습니다. 트리졸에 20% v/v의 클로로폼을 짧게 넣고 짧은 소용돌이로 잘 섞어드린다.
    2. 튜브를 회전기에 4°C에서 10분 동안 배치합니다. 트리졸-클로로폼 믹스를 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 회전시하십시오.
    3. 수성 단계를 수집하고 신선한 튜브로 전송합니다.
    4. 아세테이트 용액(pH 5.5)을 최종 농도0.3M, 100 ng/ml의 coprecipitant GlycoBlue, 및 RNA침전을 위해 100% 에탄올의 2.5부피를 첨가한다.
    5. 샘플을 잘 섞고 하룻밤 동안 -80 °C에서 배양하십시오.
    6. 4°C에서 20분 동안 12,000 x g의 샘플을 회전시키고 작은 파란색 펠릿이 튜브 의 바닥에 볼 수 있습니다.
    7. 상체를 제거하고 펠릿을 75% 얼음 차가운 에탄올850μl로 4°C에서 10분 동안 12,000 x g로 세척합니다.
    8. 상체를 조심스럽게 제거하고 RNA 펠릿을 최대 7-10분 동안 공기 건조시하십시오.
      참고: RNA 펠릿을건조하면 용해도가 매우 어려워집니다.
    9. 일단 건조되면, RNA 펠릿을 RNA 자유 수의 10 μl에서 재중단하고 RNA 농도를 결정합니다.
      참고: 분광계를 사용하여 RNA 농도를 결정합니다. 즉시 사용하지 않을 때는 RNA를 -80°C로 저장하십시오.
  3. 단일 뉴런에서 aRNA 합성:
    1. 시판되는 선형 RNA 증폭 시스템을 사용하여 RNA(실험 목적에 따라 하나 또는 두 개의 탄환)를 증폭시한다.
      참고: 단일 뉴런의 총 RNA는 ~10-60 ng범위입니다. 증폭의 첫 번째 라운드의 예상 수율은 ~100-300 ng이며, 증폭의 두 번째 라운드는 RNA의 ~0.8-1.5 μg이다.
  4. RNA의 역 전사:
    1. aRNA에서 cDNA를 생성하려면 역전사 반응의 20 μl에 aRNA 1.0 μg를 사용하십시오. 이러한 목적으로 여러 키트를 시판할 수 있습니다.

      참고: cDNA는 열 사이클러에서 다음 설정을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 합성되었습니다.
      25°C에서 5분
      42°C에서 30분
      85°C에서 5분
      4°C에서 유지
    2. 역전사 단계 후, cDNA를 -20°C에 저장하여 장기 저장한다.
  5. 프라이머 설계 및 표준화:
    실시간 증폭을 위해 프라이머를 설계하기 위해 몇 가지 우수한 소프트웨어 프로그램을 무료로 사용할 수 있습니다.
    1. 70-110 bp 앰플리통을 생성하고 상업적 인 소스를 사용하여 프라이머를 합성 하는 18-24 mer 올리고 뉴클레오티드를 선택합니다.
      참고: 2~3개의 프라이머 쌍은 관심있는 각 유전자를 위해 설계되어야 합니다. 각 프라이머 세트는 qPCR에 의해 표준화되어야 합니다. 유전자 CREB1(그림 4)에사용되었던 전방 및 역 프라이머 쌍은 다음과 같습니다.

      프라이머 세트 1
      포워드: 5'-TGATTCTGACGCAAAAAAAAAAAAA-GA-3'
      역: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTGGTAGGTAGA-3'
      프라이머 세트 2
      포워드: 5'-아가트GTCGATGA아가아가-3'

      역: 5'-GACACACAGGAAGTCAAA-3'
    2. 다운스트림 해석에 사용할 최적의 프라이머를 선택하려면 qPCR에서 Ct 값과 증폭 곡선의 모양을 모니터링합니다.
      참고: PCR의 기하급수적 단계 동안 40개의 원형 증폭 및 매끄러운 곡선에서 Ct(사이클 임계값) 값을 제공하는 프라이머는 유전자 발현 분석을 위한 최적의 다.
  6. 정량적 실시간 PCR (qPCR):
    참고: qPCR 기계와 호환되는 적절한 튜브 또는 플레이트를 사용합니다.
    1. 핵증 이없는 물로 cDNA를 5배로 희석시다.
    2. 희석 된 cDNA의 2 μl에, H2O의 2 μl, 2 x SYBR 그린 마스터 믹스의 5 μl, 10 μM (각) 전방 및 역 프라이머를 포함하는 qPCR 마스터 믹스의 8 μl을 추가합니다.
    3. 튜브를 닫고 cDNA와 마스터 믹스를 피펫팅 한 후 플레이트를 밀봉하십시오. 30초 동안 1,500rpm에서 부드러운 두드리고 회전하여 내용들을 섞습니다.
    4. qPCR 기계 설정으로 진행합니다.

결과

이 연구에서 사용 된 동물의 무게는 100-200 g에서 배열. 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 2-5 g에서 200-300 g에 구역 수색하는 동물에서 분리된 복부 신경의 신경의 전기 생리학적 측정 및 분자 분석을 실시했습니다.

프로테아제 치료의 표준화는 신경교에서 뉴런의 성공적인 전기 생리학적 측정에 중요합니다. 처음에, 다중 프로테아제(Dispase) 농도 및 지속시간이 사용되었고 R15 뉴?...

토론

뉴런 R15는 심혈관 조절, 소화, 호흡기 및 생식시스템(30)에관여한다. AP의 정기적으로 리듬 파열 활동은 R15의 특징입니다. 결과 섹션에 도시된 바와 같이, R15 및 L7의 페어링된 레코딩은 신경리아 제제가 R15 뉴런의 활성을 보존하고 있음을 보여준다. R15 및 L7 뉴런은 Ach에 적절하게 반응했습니다. 이 신경질 제제는 8-10 시간까지 유지 될 수 있고 전기 생리 활성은 지속적으로 모니터링 될 수있?...

공개

저자는 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 말

화이트홀 재단이 이 사업을 수행한 스크립스 연구소의 자금 지원과 스타트업 기금에 진심으로 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AplysiaNational Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaClSIGMAS 3014-1KG
KClSIGMAP 9333-500G
CaCl2•2H2OSIGMAC5080- 500G
MgCl2•6H2OFisher ScientificBP 214-501
NaHCO4SIGMAS 6297-250G
HEPESSIGMAH 3375-500G
ProteaseGIBCO17105-042
TrizolAmbion15596-026
ChloroformMP Biomedicals2194002
100% EthanolACROS64-17-5
GlycoBlueAmbionAM9515
3 M NaOAc, pH 5.5AmbionAM9740
Nuclease free waterAmbionAM9737
MessageAmp II aRNA Amplification KitAmbionAM1751
qScript cDNA SuperMixQuanta Biosciences95048-100
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
ForcepsFine Science Tools11252-20
ScissorsFine Science Tools15000-08
Stainless Steel Minutien Pins Fine Science Tools26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal CyclerApplied BiosystemsVeriti Thermal Cycler
5430R CentrifugeEppendorf5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCRApplied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR
AmplifierBRAMP-01RNPI Electronics
Digidata ConverterInstrutech ITC-18HEKA ELEKTRONIK
Micro ManipulatorPatch StarScientifica

참고문헌

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