Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Resumo

Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento.

Resumo

Testando o destino de células-tronco embrionárias de derivativos ou pluripotentes in vitro protocolos levou a resultados controversos que não necessariamente refletem seu potencial in vivo. De preferência, essas células devem ser colocados num ambiente embrionária adequada, a fim de adquirir o seu fenótipo definitiva. Além disso, células de linhagem rastreamento estudos no rato após marcação das células com corantes ou vetores retrovirais permanece mais limitada a embriões de camundongos em fase inicial com órgãos ainda pouco desenvolvidos. Para superar essas limitações, nós projetamos protocolos microinjeção padrão e mediada por ultra-som para injetar vários agentes em regiões-alvo do coração em embriões de camundongos em E9.5 e estágios mais avançados de desenvolvimento. Explante embrionárias ou embriões são então cultivados ou à esquerda para continuar a desenvolver no útero. Esses agentes incluem corantes fluorescentes, vírus, shRNAs, ou células-tronco progenitoras derivadas de células. Nossos abordagens permitir preservação do function do órgão durante o acompanhamento de migração e destino de células marcadas e / ou injetadas. Estas tecnologias podem ser estendidos a outros órgãos e será muito útil para abordar questões biológicas fundamentais em biologia do desenvolvimento.

Introdução

Mais de uma década atrás, as células-tronco embrionárias humanas (HuESCs) foram derivadas de blastocistos humanos ^1. Desde então, estas células tornaram-se objecto de um importante campo de pesquisa que aborda questões não satisfeitas em biologia do desenvolvimento humano. HuESCs ter ainda fornecido esperanças na medicina regenerativa. Nos últimos anos, as células estaminais pluripotentes humanas induzidas (iPSCs) foram geradas a partir de células somáticas de doentes específica, o fornecimento de modelos de doença genética ^2. Muitos em protocolos in vitro para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas ou embrionárias para várias linhagens celulares, incluindo linhagens coração ^3, foram relatados. As células diferenciadas são frequentemente fenotipadas por análise de ARN e a expressão da proteína, a imunocoloração, e / ou em testes funcionais in vitro. No entanto, os derivados de células estaminais pluripotentes tem que ser colocada num ambiente embrionária adequada, a fim de testar se adquirem totalmente o cell destino de suas contrapartes embrionárias e se recapitular a função in vivo genuíno em resposta às sugestões regionais. Enquanto a engenharia de tecidos é promissor, ainda não fornecem todos os sinais conhecidos e desconhecidos do bom desenvolvimento in vivo tecido embrionário ^4,5.

Rotulagem celular com corantes ou vetores retrovirais em embriões, incluindo embriões de camundongos, trouxeram informações importantes sobre a origem embrionária das linhagens de células durante o desenvolvimento cardíaco ^6. Por exemplo, corante de injecção para dentro do espaço pericárdico de embriões de ratinho ex vivo, seguido de cultura in vitro de corações isolados, foi usado para marcar as células do epicárdio e seus descendentes ^7. No entanto, corante e marcação celular retroviral foram aplicados principalmente para embriões de rato com os órgãos ainda pouco desenvolvidos, ou embriões de galinha, que são mais facilmente acessível ^8. Uma exceção é o cérebro, que é mais fácil de atingir em embryos ^9,10. Tal abordagem ainda não tenha sido aplicada ao coração do rato embrionário de bater.

Para complementar a rotulagem direto com corantes ou vírus e para realizar o rastreamento em estágio mais avançado embriões de camundongos e ratos adultos da linhagem, a abordagem marcação celular foi combinada com análise de camundongos transgênicos, utilizando a tecnologia Cre / Lox. A abordagem Cre / Lox ¹¹ apresenta no entanto algumas limitações devido à especificidade espaço-temporal das regiões reguladoras genómicas utilizadas para conduzir a expressão da recombinase, e a eficiência da recombinação Cre / Lox ^12. Além disso, esta abordagem não contempla plenamente as questões específicas de aquisição orientada a migração de células de destino da célula, uma vez que só pode rotular um precursor após a ativação da região reguladora usada para dirigir a expressão Cre. Ele também não pode aplicar-se a embriões humanos para as questões éticas óbvias.

Dadas essas limitações, nós projetamos uma série de novos protocols para injectar uma variedade de agentes de marcação de células, tais como corantes fluorescentes, vírus, moduladores de expressão de genes, tais como vectores de rotulagem e shRNAs celular à base de ADN, ou células no embrião de rato em E9.5 e as fases posteriores do desenvolvimento em regiões alvo do coração.

As injeções de DNA / celulares usar uma lupa e um dispositivo de microinjeção simples combinado com ex vivo de cultura de embriões de até 48 horas, ou de coração isolado ou cultura explante embrionário para 48-72 horas. Nós também relatam um protocolo de microinjeção mediada por ultra-som nos corações embrionárias de rato no útero. Esta técnica permite acompanhar o desenvolvimento de embriões ¹³ e permite a longo prazo de seguimento dos injectates e / ou células marcadas.

Descobrimos que estas abordagens preservar a função do órgão e proporcionar um ambiente mais representativo do que os testes in vitro de potencial de células estaminais. Ele também oferece a oportunidade de acompanhar a migraçãode rotulados e / ou injetaram células para controlar o seu destino. Em última análise, este deve proporcionar uma melhor compreensão da padronização tecido regional e processos biológicos fundamentais.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Preparação

Procedimentos com animais

Obter a aprovação de um comitê de ética animal e seguir as orientações institucionais para o trabalho com o vírus, HuESC e / ou iPSC (quando aplicável), bem como a movimentação do mouse, a obtenção de embriões de camundongos, e realizar a cirurgia mouse. Para acasalamentos programados, o dia do plugue é considerado dia embrionário (E) 0,5 / 0,5 dias pós-coitum.

1. Agulhas microinjeção:
   Para ex utero microinjeção, puxe pipetas de vidro (1,2 milímetros de diâmetro tubos de borosilicato capilares externos) utilizando um extrator pipeta / beveller para obter uma mM diâmetro da ponta interna 1 ou 10 e uma forma cônica e ponta afiada para injetar DNA ou células, respectivamente. Para injeções mediada por ultra-som, o uso personalizado agulhas estéreis, que têm um diâmetro externo / interno (OD / ID) de 1,14 mm/0.53 mm, com uma ponta de 50/35 mM OD / ID.
2. Placas de Petri de silicone-cheia:
   Prepare de silício como descrito no manual. Preencherum copo limpo 60 mm de diâmetro placa de Petri com uma camada de elastômero de ~ 1 cm. Evitar bolhas de ar.
3. Instrumentos:
   Manter todos os instrumentos cirúrgicos estéreis, antes e durante o procedimento.
4. Preparação de DNA:
   Adiciona-se 3 ug de ADN e 12 uL de Opti-MEM em um tubo. Adiciona-se 3 mL de Lipofectamine 2000 e 12 ul de Opti-MEM em outro tubo. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e misturar as duas soluções. Use imediatamente.
5. Preparação celular:
   Prepara-se uma suspensão de 10 ⁶ células / ml de DMEM (Meio de Eagle de Dulbecco, glicose alta e 50% de soro de rato). 50 ul da suspensão celular final é suficiente para 8-10 embriões.
6. Tingir preparação:
   Use o verde fluorescente CDCFDA-SE a 25 mg / ml de DMSO. Prepare 20 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C. Diluir 1:100 / 1:200 em soro fisiológico estéril ou com PBS antes da utilização.
7. Preparação de vírus:
   Use um PGK-expressando GFP lentivírus comercial 3 ^ª geração com um título de ~ 10 ⁹ -10 ¹⁰ transducing unidades / ml de DMEM. Para a preparação do lentivírus, consulte Tiscornia et al ^14. Use equipamento de proteção pessoal e usar e dispor de vírus com segurança.

2. Recolha de E9.5 e E10.5 embriões para Ex vivo Injeção

1. Euthanize um rato grávida no dia embrionário 9.5 ou 10.5.
2. Esterilizar o tórax e abdômen do mouse com etanol 70%.
3. Faça uma incisão na linha média ventral para abrir o abdômen e recuperar o corno uterino na RT em PBS e transferi-lo depois de duas lavagens de PBS para uma placa de Petri cheia de silicone com o meio M16.
4. Pin o corno uterino com pinos de insectos para a camada de silicone, de modo que o lado vascularizado do útero é, na parte inferior.
5. Cortar a superfície do útero com uma pinça fina, e uma tampa do decidua em 1 mm abaixo da superfície.
6. Gentilmente recuperar o embrião no saco vitelino, espalhando para fora das paredes da decídua.
7. Guarde os embriões a 37 °, C em meio M16 antes da injeção das células. Para a injecção, cada embrião é transferido para o prato de silicone enchida com meio M16 pré-aquecido a 37 ° C.

3. DNA ou injeção de células sob microscópio estereoscópico

1. Encha a pipeta de vidro na parte de trás com uma seringa Hamilton e agitar a pipeta para remover as bolhas na ponta.
2. Defina a pipeta no suporte da microinjeção; definir a pressão de retenção de 50 (ADN) ou 30 (células) hPa, e a pressão de injecção de 150 (ADN) e 300 (células) hPa. Defina o tempo de injeção para 0,2 seg (DNA) ou 0,5 s (células). Estas configurações podem variar ligeiramente de acordo com o tipo de microinjector e pipeta.
3. Pin o embrião para a parte inferior de silicone através do saco vitelino, sem tocar no próprio embrião. Cuidado a região do coração e abrir o saco logo acima desta região.
4. Adicione 4 pinos ao redor do embrião para evitar qualquer movimento durante a injeção de células.
5. Usando o micromanipulador (definido para manual), slowly posição da ponta da pipeta a um ângulo de 45 ° acima do pericárdio, logo acima da região do coração, que é para ser injectada (Figura 1).
6. Mova a pipeta na região de interesse e acionar a injeção. Retire a pipeta, tão rapidamente quanto possível. Certifique-se o coração está batendo corretamente após a injeção de DNA / célula.

4. Embrião, coração isolado e Explant Cultura

1. Cultura de embriões E9.5 em 25% M2 médio e 75% de soro de rato, suplementado com penicilina / estreptomicina, pré-aquecido a 37 ° C e oxigenada com 40% de O _2.
2. Adicionar 2 ml de meio de cultura num tubo de vidro de 25 ml, adicionar cuidadosamente o embrião, e oxigenado com 40% _O2 antes de aparafusar a tampa no tubo. Incube-se a 36 horas a 37 ° C durante a rotação ou agitação (30 rotações / min).
3. No ponto de tempo desejado (por exemplo, 24 horas), dissecar o coração cuidadosamente com uma pinça fina, sem tocar os corações, por primeiro decapitating os embriões; o coração é fácil de impostos especiais de consumo, puxando-o usando a via de saída distal.
4. Cultura do coração isolado para outro 36-48 horas em DMEM com 50% de FCS num inserto Matrigel revestido definido em uma placa de 12 poços. Veja Dyer & Patterson (2013) para um protocolo melhorado da cultura coração ^15.
5. Faça qualquer explante da região de interesse. Como exemplo, dissecar o canal atrioventricular (AVC) e cultura-lo por 48 horas em colágeno tipo 1 gel ^16.

5. Injeção de ultra-som-guiada no Coração I n utero

1. Configuração da máquina de ultra-som e microinjetor:
   1. Use o sistema de ultra-som de alta resolução com um transdutor de 40 MHz e configuração microinjeção em um trilho.
   2. Defina o volume de injeção na microinjetor em 69 nl por injeção. Consulte o manual de microinjeção do fabricante para a programação do microinjetor.
2. Preparação do microinjection instalação e injeção:
   1. Coloque uma micropipeta de vidro no microinjetor. Para assegurar a injecção, o primeiro revestimento eficiente o lado interior da pipeta com óleo mineral, aspirando-se para o volume máximo. Em seguida, retire o óleo novamente, deixando 1-2 mm de óleo no interior da agulha.
   2. Aspirar o produto de injecção até que o volume máximo é atingido. Tenha cuidado para não tocar em qualquer superfície com a ponta da agulha, pois isso vai enfraquecer a ponta e fazer a injeção mais difícil.
   3. Para estabilizar o corno uterino contendo os embriões durante a injecção, utilizar um prato Petri modificado com um furo no meio (2,5 cm de diâmetro), coberta por uma fina membrana de silicone com uma pequena fenda de corte no centro, e posicioná-lo acima do local da incisão . Estabilizar a placa de Petri sobre a mesa de manuseamento rato posicionando 3-4 aglomerados de argila de acordo com as bordas do prato.
3. Processo de injeção:
   1. Raspar o abdômen de um rato grávida (na fase embrionária desejado) antes da anestesiasia para remover pêlos. Trate o abdômen com um agente de depilação química para remover pêlos residual e esterilizar com álcool 70%.
   2. Anestesiar um rato grávida de oxigênio / isoflurano através de uma máscara facial. Use 3-5% de isoflurano em 100% de oxigénio durante a anestesia inicial, seguido de 1-1,5%, durante o resto do procedimento. Certifique-se de que o mouse está devidamente anestesiados por beliscar suavemente suas patas e / ou cauda.
   3. Colocar o rato supina sobre a mesa de tratamento do rato (ajustado para aquecer a 37 ° C) e cobrir os olhos com lubrificante para evitar a desidratação da córnea.
   4. Aplique gel eletrodo sobre os eletrodos e cole as patas para os eletrodos para monitorar a frequência cardíaca, frequência respiratória, e ECG. Coloque um termômetro retal para monitorar a temperatura do corpo.
   5. Verifique primeiro se o rato está grávida, visualizando e contando os embriões por ultra-som. Aplique o gel de ultra-som no abdômen e posicionar a cabeça de leitura acima da bexiga. Para manter a consistência, visualizar a bexiga em primeiro lugar,e contagem de embriões na esquerda e cornos uterinos direita, a partir da posição da bexiga. Certifique-se de que os corações embrionárias estão batendo normalmente.
   6. Se o mouse está grávida, posicione a placa de Petri acima do local da incisão futuro com o barro. Pressione levemente o prato para o abdômen, para que o prato está em contato direto.
   7. Retire o prato e esterilizar o abdômen novamente. Faça um 1,5-2 cm ventral incisão mediana, cerca de 0,75-1 cm acima da vagina, para abrir o abdômen e peritônio. Evite lesões de órgãos internos.
   8. Exteriorizar a esquerda ou corno uterino direito com uma pinça, puxe-o através da membrana de silício do prato, e estabilizar o prato no barro novamente. Impedir extensa puxar ou manipulação, uma vez que isso pode causar sangramento dos vasos uterinos e morte prematura da mulher e / ou embriões.
   9. Conte os embriões novamente para garantir a manutenção de registros adequados de que os embriões foram injetados.
   10. Aplique o gel de ultra-som no ucornos uterino a imagem do coração e para evitar a desidratação.
   11. Imagem do primeiro embrião a ser injectado. Verifique batida normal do coração embrionário e manter registros de orientação crânio-caudal e esquerda-direita do embrião. Se necessário, reposicionar o corno uterino ligeiramente para assegurar orientação apropriada. Se isso for difícil, passar para a próxima embrião.
   12. Perfurar o útero cuidadosamente com a agulha de microinjecção para posicionar a agulha com um ângulo de 45 ° acima do embrião, ligeiramente fora do pericárdio (Figura 3). Para marcação de células do epicárdio, a imagem do coração em uma visão de quatro câmaras e posicionar a agulha para que ele aponta para o sulco atrioventricular (Figura 3). Se o ângulo precisa ser ajustada, puxe a agulha, e reposicionar. Não ajustar o ângulo com a agulha dentro do útero, uma vez que isto pode quebrar a agulha. Evitar a perfuração de outros tecidos, tais como membros ou placenta.
   13. Mover a agulhana parede do pericárdio e perfurá-la com um movimento suave, mas rápido. De um modo geral, haverá alguma resistência, mas movendo-se a agulha demasiado rápido pode fazer com que a ponta da agulha para perfurar o próprio coração. A ponta deve acabar no espaço pericárdico do sulco atrioventricular. No caso de hemorragia pericárdio, as células do sangue será visível como um padrão de neve como branco. Se este for o caso, pare de injetar o embrião e passar para outro embrião.
   14. Injectar a injetado. Injectar maximamente 700 nl no espaço pericárdico para evitar efeitos adversos sobre o desenvolvimento corações. Monitorar a injeção adequada, ligeiro inchaço, temporal do saco pericárdico.
   15. Após a injecção, retire a agulha e confirmar que injectado pode ainda ser ejectado para assegurar que a agulha não foi obstruído por fragmentos de tecido.
   16. Reposicionar a tabela de manipulação de imagem e para injectar o lado do embrião. Manter o número de embriões injectados a um máximo de 3-4 (em uma trompa uterina) para impediralargado anestesia, para permitir a embriões de controlo no corno uterino opostos, e para assegurar que o procedimento não perturbar o desenvolvimento embrionário.
   17. Depois de injectar o número desejado de embriões, remover o excesso de gel de ultra-som e colocar suavemente a trompa uterina de volta para o abdómen na sua posição correcta.
   18. Fechar o abdómen da mãe usando uma camada de fio de sutura para o peritoneu e os músculos abdominais, e uma segunda camada de fio de sutura para a pele.
   19. Injetar o mouse com a primeira dose de medicação para dor. Use uma injeção de 0,05-0,1 mg / kg de Buprenorfina 15 min antes do término da anestesia e três injeções adicionais com intervalos de 12 h.
   20. Descontinuar anestesia e monitorar o mouse para a recuperação adequada do procedimento. Casa do rato grávida em uma gaiola individual para o período desejado de follow-up.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Utilizando os protocolos de injecção descritos acima, as células podem ser identificadas e / ou injectado no coração embrionário do rato. Como prova do conceito, vários exemplos são mostrados na qual o protocolo de injecção e o ex vivo AVC explante, isolado do coração, ou a cultura do embrião inteiro foram combinadas (Figura 1).

A Figura 1 mostra a preparação do embrião, antes da injecção das células. O embrião E9.5 é removido d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Os ex vivo protocolos de injeção intra-cardíacas descritas acima são projetados para preservar a função miocárdica por pelo menos 48 horas, em meados de estágio (E9.5-E11.5) embriões de camundongos. Estas abordagens de injecção de permitir a injecção espacialmente direccionada de DNA ou células. Os poucos exemplos mostrados nas Figuras 1-3 fornecer prova de conceito para delinear ex vivo e em mecanismos moleculares in vivo de processos de desenvolvimento...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019