Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

Resumo

O mouse do bulbo olfativo acessório (AOB) tem sido difícil de estudar, no contexto da codificação sensorial. Aqui, nós demonstramos uma dissecação que produz uma preparação ex vivo em que os neurônios AOB permanecem funcionalmente ligados às suas entradas periféricas, facilitando a investigação sobre o processamento de informações de feromônios e cairomônios rato.

Resumo

O sistema olfativo acessório rato (AOS) é um caminho sensorial especializado para detectar odores voláteis sociais, feromônios e cairomônios. O primeiro circuito neural na via AOS, chamado bulbo olfatório acessório (AOB), desempenha um papel importante no estabelecimento de comportamentos típicos do sexo, como a agressão territorial e acasalamento. Este circuito pequeno (<1 mm ³⁾ possui a capacidade de distinguir estados comportamentais únicas, tais como sexo, tensão e estresse a partir de sugestões de quimio nas secreções e excreções de animais da mesma espécie. Enquanto a organização compacta deste sistema apresenta oportunidades únicas para a gravação de grandes porções do circuito ao mesmo tempo, a investigação de processamento sensorial no AOB continua sendo um desafio, em grande parte devido à sua localização experimentalmente desvantajosa no cérebro. Aqui, nós demonstramos uma dissecação de várias etapas que remove a AOB intacta dentro de um único hemisfério do crânio anterior mouse, deixando conectaríons para ambos os vomeronasais periférica neurônios sensoriais (VSNs) e circuitos neuronais locais intactos. O processo apresenta a superfície de MAA para dirigir a inspecção visual, facilitando electrofisiológico e gravações ópticas de AOB elementos de circuito, na ausência de anestésico. Após a inserção de uma cânula fina no órgão vomeronasal (VNO), que abriga os VSNs, pode-se expor diretamente da periferia de odores e feromônios sociais durante a gravação de actividade a jusante da AOB. Este procedimento permite investigações controladas em AOS processamento de informação, que pode lançar luz sobre mecanismos que ligam a exposição feromônio a mudanças no comportamento.

Introdução

Processamento sensorial no cérebro de mamíferos tipicamente se estende por vários circuitos neuronais reciprocamente conectados, cada um dos quais extrai as características particulares de estímulos sensoriais. Em vias sensoriais, processamento de informação precoce é vital para a percepção eo comportamento normal. No sistema olfativo acessório (AOS), o bulbo olfativo acessório (AOB) é o principal circuito neural que liga a periferia sensorial para estruturas a jusante que ditam o equilíbrio hormonal ^1,2, agressão ³ e ⁴ excitação. Como tal, o processamento de informações dentro deste circuito está fortemente ligada a mudanças no comportamento animal.

O bulbo olfativo acessório está localizado em camundongos e ratos no aspecto dorsal / caudal / posterior do bulbo olfatório (MOB) sob o denso, vascularizado seio rinal. A AOB recebe inervação aferente de axônios dos neurônios sensoriais vomeronasais periférica (VSNs) que residem no órgão vomeronasal (VNO), um small tubo cego terminou no focinho anterior logo acima do palato mole. Estes axónios atravessar a folha de tecido delicado do septo no limite medial das passagens nasais. Vários estudos investigaram as respostas neurais AOB a fontes de odores AOS (tais como a urina de rato) in vivo com ratos anestesiados ^5-7 ou animais livremente explorando ^8. O heróico anestesiados estudos in vivo envolvidos (a) traqueostomia para garantir a anestesia profunda e evitar a aspiração de estímulos líquido ^5-7, (b) de estimulação do gânglio cervical simpático ⁶ ou punção direta do órgão vomeronasal ^5,7 introduzir odores voláteis e (c) com ou sem craniotomias ablações do lobo frontal para permitir o avanço do eléctrodo para o MAA ^6. Awake / comportando estudos ^8-10 implantação cirúrgica envolvida de um Microdrive. Em suma, esses paradigmas experimentais são poderosos, mas extremamente difícil e muitas vezes requer anestesia.

Curiosamente, vários estudos tentaram manter estruturas sensoriais e circuitos neurais jusante vivos fora do corpo (ex vivo) com algum sucesso ^11-15. Porque as conexões entre o VNO e AOB permanecer ipsilateral, e porque o tecido da linha média do septo pode ser exposto a superfusate oxigenado em um único hemisfério, buscou-se desenvolver uma abordagem ex vivo de um único hemisfério para isolar essas estruturas, mantendo sua conectividade funcional. Recentemente, conseguiu atingir esta meta ^16. Esta preparação mantém tanto o VNO e AOB vivo e funcionalmente ligados por pelo menos 4-6 horas porque ambos os axônios (ao longo do tecido septal suave linha média) e AOB são relativamente rasas <600 mM recursos que são acessíveis a superfundidos oxigenado artificial líquido cefalorraquidiano ( ACSF). Este VNO-AOB ex vivo preparação permite a introdução de estímulos controlados para o VNO através de uma cânula fina, eacesso visual direto para a pequena AOB para a colocação do eletrodo-alvo e / ou microscopia de fluorescência ao vivo. Este método é vantajoso quando se deseja estudar estes circuitos na ausência de anestésico. Como essa abordagem rompe ligações centrífugas, não é bem adequado para investigações sobre a modulação da função centrífuga AOB. O VNO-AOB ex vivo preparação é difícil de aprender, mas uma vez alcançado produz uma plataforma confiável sobre a qual a investigar organização circuito, processamento de informação, e plasticidade neural neste circuito sensorial poderosa.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de UT Southwestern Institutional Animal Care e Use, e foram escolhidos de modo a minimizar o estresse, desconforto e dor experimentada pelos animais experimentais.

1. Dissecção Secção

Uma câmara de dissecção personalizada e pequena, prancha fina de plástico são necessários para obter os melhores resultados (Figura 1). Construir ou obter tal câmara antes de tentar esse protocolo.

2. Soluções de dissecação

1. Prepare 1 litro de padrão artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) para uso em Passos 3,22-5,4. Adicionar NaCl a 125 mM, KCl 2,5 mM, _CaCl2 2 mM, _MgCl2 1 mM, _NaHCO3 25 mM, NaH ₂ PO ₄ 1,25 mM, mio-inositol, 3 mM, piruvato de sódio 2 mM, ascorbato de sódio 0,4 mM e glicose 25 mM a 1 L de água pyrogen livre.
2. Prepare o ACSF dissecção inicial (200 ml) parausar nos passos 3,3-3,22. Tome 200 ml de aCSF Padrão e aumentar a concentração de _MgCl2 por 9 mm, adicionando 0,366 g de _MgCl2 hexahydrate.
3. Preparar uma solução-padrão de Ringer para transportar estímulos à VNO através da cânula para utilização em passos 4,11-5,4 contendo NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl _2, 2 mM, _MgCl2 2 mM, _NaHCO3 25 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM.
4. Bolha a 0,8 L de aCSF padrão e 0,5 L de Ringer com 95% _de O2, 5% de CO ₂ de gás em um banho de água a 37 ° C durante um mínimo de 15 min, até utilização.
5. Bolha os 200 ml de aCSF dissecção inicial com 95% _de O2, 5% de CO ₂ de gás em gelo durante 15-20 minutos, até que atinge 4 ° C.

3. Dissection primária

1. Preparar a área de dissecção. Coloque três pratos de Petri 35 milímetros, oxigenado aCSF, tesouras decapitação, curvas dissecando tesoura, tesoura reta dissecando, fórceps Adson, um couro cabeludo # 11lâmina el e punho e uma lâmina de barbear no gelo.
2. Após oxigenado aCSF foi arrefecida a 4 ° C, profundamente anestesiar os animais numa câmara de dessecação usando 2-5 ml Isothesia (99,9% de isofluorano). Realizar testes de esmagamento da cauda e do pé para garantir que o animal está profundamente anestesiada.
3. Depois de uma anestesia profunda é confirmada, decapitar o animal e colocar imediatamente a cabeça numa placa de Petri cheio com o ACSF dissecção gelado. NOTA: Mergulhe o tecido em dissecção refrigerados aCSF para mantê-lo fresco durante todo o procedimento, quando não em uso.
4. Retire o aspecto inferior (ventral faringe, mandíbula e língua) com uma tesoura curva.
5. Usando Adson fórceps deglove (casca) da pele superficial e anexos musculares do crânio. Descasque o couro cabeludo de caudal para rostral até o único local de ligação é sobre os dentes da frente. Corte o tecido no ponto de fixação usando uma tesoura curva. Remova os olhos, segurando-o com uma pinça e puxá-lo para longe da preparação. Norelha a fim de o processo de Degloving, evitar o excesso de força sobre a cartilagem nasal delicada usando fórceps Adson para ligamentos musculares livres dos ossos do maxilar superior. NOTA: Retire o couro cabeludo do aspecto caudal do crânio com tesoura reta.
6. Com a tesoura reta, cortar a linha média do crânio de caudal para rostral até que as pontas de tesoura são alguns mm para os ossos frontais (apenas antes do seio rinal).
7. Retire o parietal e ossos frontais do crânio usando uma pinça Adson. NOTA: As partes do osso frontal, muitas vezes, permanecer solidários com os ossos nasais caudais ao seio rinal. Remova os pedaços com o cuidado de não contactar os bulbos olfatórios.
8. Use o bisturi para fazer um corte coronal através do lobo frontal 2 milímetros caudal para os seios e, em seguida, remover o caudal do cérebro para o corte. Garantir a ponta dos contatos bisturi o contorno ósseo do crânio ventral para cortar completamente o tecido posterior. NOTA: Isso permite queremoção da maior parte do cérebro, sem colocar estresse mecânico sobre os tratos olfatórios laterais ou bulbos olfatórios.
9. Retire os aspectos caudais expostas do crânio ventral com tesoura reta. Deixe os seios e tecido nervoso remanescente.
10. Retire o arco zigomático e músculos faciais no lado anatômico direito do crânio usando tesoura reta
11. Vire o focinho longo (lado ventral para cima) para expor o céu da boca.
12. Corte e retire o paladar imediatamente caudal aos incisivos. Faça isso inserindo a ponta da lâmina de bisturi sob o paladar paralelo ao céu da boca e, em seguida, mover a lâmina para os incisivos.
13. Segure a (rostral) borda livre do palato com uma pinça Adson e retire puxando caudal.
14. No lado esquerdo anatómica do crânio, utilizar a lâmina de bisturi para estender os forame palatino caudal, a partir das pequenas forame próximos molares. Conseguir isso inserindo a ponta do bisturi blades para o vazio perto dos molares e rotação do pulso. NOTA: Tenha muito cuidado ao usar apenas a ponta da lâmina - um corte profundo pode danificar o tecido septal.
15. Com a ponta da lâmina de bisturi, cortar a partir do forame palatino através dos incisivos, a partir rostral ao órgão anatómica vomeronasal esquerda. Utilize múltiplos cortes de pontuação. Não danificar o tecido septal e os nervos vomeronasais inserindo a lâmina muito profundo.
16. Vire o tecido de modo que o crânio dorsal está voltada para cima e, em seguida, orientar a lâmina reta na vertical (paralela à linha média) na borda caudal da preparação.
17. Na borda ventral do tecido, tocar a borda cortante da lâmina de barbear imediatamente à esquerda da linha média. Agite suavemente a lâmina e se movem ao longo do forame palatino esquerdas (cortar região introduzida na etapa 3.14).
18. No bordo dorsal do tecido, colocar a aresta de corte da navalha imediatamente à esquerda da linha média (inferior a 1 mm).
19. Manutençãoa lâmina paralela à linha média, agitar a lâmina lentamente com pressão em direcção ao anterior do tecido. Observe resistência na lâmina crivosa. Pare imediatamente após romper essa resistência. NOTA: Neste ponto, o hemisfério direito é solto a partir do hemisfério esquerdo. A conexão só é remanescente entre os hemisférios ao longo da dorsal focinho anterior à lâmina crivosa.
20. Separe os hemisférios, segurando-os perto dos lados caudais com os dedos enluvados e suavemente girando-os lateralmente e anteriormente. NOTA: Este passo é uma fonte de variabilidade experimental, especialmente em ratos com focinhos desviadas ou frágeis (por exemplo, ratos mais velhos). Além disso, ao tentar rodar os hemisférios de distância um do outro, se a resistência a forte for encontrado marcar o focinho dorsal (anterior à placa cribriforme) para enfraquecer os tecidos conjuntivos. Enquanto isso, tome muito cuidado para não inserir o bisturi profundamente, o que pode danificar a ti septalssue e nervos vomeronasal.
21. Aplique uma pequena quantidade (50-100 L) de cola de tecido para a prancha e coloque delicadamente a borda lateral do hemisfério direito para a cola usando a pinça Adson. Retire o excesso de umidade do lado lateral da preparação usando uma toalha de papel para evitar a polimerização prematura cola e adesão solto para a prancha. NOTA: Aplicar algumas gotas de dissecação o ACSF gelado na amostra para acelerar a polimerização de cola após o tecido é colocado sobre a cola. Isto assegura que o tecido se mantém firmemente retida à prancha.
22. Colocar uma pequena quantidade (3-5 mm de diâmetro, 2 mm, de profundidade) de graxa vácuo no meio da câmara de dissecção secundário e colocar o lado da prancha em frente ao tecido firmemente contra a graxa. Preencher imediatamente a câmara com dissecção refrigerados aCSF dissecção, a transferência para a área de dissecção fina e começar a perfusão com padrão aCSF oxigenado. Oriente a prancha para que o bulbo olfativo é diretamente nafluxo de aCSF padrão recém-oxigenado.

4. Dissecção secundário

1. Remova qualquer contralateral (esquerdo) bulbo olfatório visível ou tecido cortical da preparação usando uma pinça fina. Segure as pinça fina (formando um ponto sem corte semi), e, em seguida, colocá-lo no dorsal e porção caudal do tecido perto da linha média. Suavemente executar o fórceps pinçados ao longo da linha média, descamação do tecido longe do hemisfério direito lentamente em movimento anterior. Remover todo o tecido contralateral, incluindo o tecido bulbo olfativo contralateral. Tome muito cuidado para não apunhalar através do tecido, o que pode causar danos ao AOB ou nervo vomeronasal.
2. Observe a dura-máter branco ao longo da superfície dorsal / medial do bulbo olfatório. Arrancar essa dura-máter ao longo da borda dorsal / caudal do bulbo olfatório, segurando na parte mais branca da dura com dois pares de uma pinça fina e puxe-los a partir desse ponto. A dura-máter é firmementeenrolada em torno do bulbo olfatório, e pode facilmente cortar através do tecido em si, enquanto ele está sendo removido. Evite danos à superfície medial do bulbo olfatório eo próprio AOB. NOTA: Se a dura resiste rasgar facilmente, neste ponto, introduzir um pequeno corte com tesoura de dissecção ponta primavera finas para facilitar a separação.
3. Lenta e cuidadosamente descascar o córtex frontal com uma pinça fina, sem danificar os bulbos olfatórios subjacentes. Observar uma coleção de vasos sanguíneos que aparecem como uma rede semi-transparente imediatamente caudal ao AOB. Remover esta rede com uma pinça fina para facilitar a penetração do eletrodo em experimentos eletrofisiológicos. Segure a net com uma pinça, uma vez que se separa da AOB durante frontal retração córtex e remova-o puxando caudal e medial, tendo o cuidado para não tocar a AOB. Uma vez que o córtex frontal foi separado dos bulbos olfativos, removê-lo através do corte com uma pinça ventrais e posteriores para o MAA. NOTA: Tome extreme cuidado com a remoção net, para se for feito demasiado aproximadamente a camada glomerular pode ser danificado.
4. Na cavidade nasal contralateral exposta, remover qualquer tecido septal contralateral restante (folha frágil amarelado contendo vasos sanguíneos), usando a pinça fina. Segure o tecido na região caudal / dorsal (perto do osso do septo) e puxe / levantar o tecido para o lado anterior. NOTA: O tecido septal contralateral pode ser inadvertidamente removido durante o passo de hemisecção (Passo 3,20). Em tal caso, observar uma cartilagem septal branco, avasculares e o osso do septo ligeiramente transparente, vascularizado. Se for este o caso, o Passo 4.4 pode ser ignorada.
5. Retire cuidadosamente o VNO contralateral, executando um único ponto dos pinça fina entre a cartilagem do septo e da "asa" VNO (um pequeno pedaço de tecido ósseo que corre ao longo da borda dorsal de ambos VNOs.
   1. Após o desprendimento da asa da cartilagem, mova a ponta do fórceps ventrallyno VNO contralateral perto da linha média. Repita este passo em vários locais ao longo do eixo caudal / rostral do VNO contralateral para soltá-lo, permitindo que ele seja removido, segurando com uma pinça e levantando distância.
6. Prepare-se para remover a cartilagem do septo, fazendo um corte na borda ventral / caudal (onde se restringe a uma faixa avascular branco corrida ao longo da borda ventral do osso do septo) com uma pinça fina.
7. Retire a cartilagem do septo por beliscar junto a pinça fina para fazer um ponto sem corte semi. Identificar o corte feito no passo 4.6, inserir a pinça pinçados por trás (lateral) para que corte, e, em seguida, levantar-se lentamente a cartilagem longe do tecido septal e procedendo rostralmente. NOTA: Não interromper o tecido septal subjacente. Como a cartilagem é levantada, observar a folha subjacente de tecido stretch septal devido a aderências frouxas para a cartilagem. Um movimento periódico, suave e estável dos pinça fina pinçados ao longo deste local de solta umdhesion pode facilitar a separação bem sucedida das duas estruturas.
8. Use um par de fórceps # 3 com uma ponta curvada para remover o osso septal. Aproximamos do osso do septo com um ângulo quase paralela ao plano do osso do septo. Insira a ponta curvada entre o tecido ósseo do septo e septal. Segure o osso com a pinça e gentilmente mover o osso e para trás até que ele racha perto da lâmina crivosa. NOTA: Em alguns casos, o osso do septo vai resistir quebrando perto da lâmina crivosa. Neste caso, use uma pinça fina para marcar suavemente o osso ao longo do septo / eixo ventral dorsal apenas anterior à lâmina crivosa, em seguida, repita o passo 4.8.
9. Retire a cartilagem branco apenas rostral ao VNO por beliscar com um par de fórceps finos na entrada e puxando rostralmente com outro par de fórceps finos.
10. Anexar a cânula de poliimida para um dispositivo de perfusão rápida e iniciar o fluxo de solução de Ringer (0,1-0,3 ml / min) através da cânula de poliimida.NOTA: vazão medida com, um medidor de fluxo pequeno volume in-line. Uso de computador controlado dispositivo de comutação pneumática estímulo reduz a alterações na taxa de fluxo durante a estimulação. Comparar as respostas neurais para testar estímulos com respostas a um estímulo simulada (controle solução de Ringer) para assegurar respostas são específicas de estímulo.
11. Oriente a cânula paralelo à entrada VNO. Quando a cânula está satisfatoriamente paralela à entrada VNO, ver como a pressão de saída faz com que o VNO para "encher", levando a evacuação do vaso sanguíneo. Imediatamente inserir a cânula no VNO, mantendo o ângulo da constante de cula, de modo que continua a ser paralela à abertura VNO. Nota: Pode ser útil para manter a cânula com um par de fórceps finos contra a prancha de plástico e usar um outro par de uma pinça fina para o ângulo de ponta da cânula ligeiramente para cima. Se, inadvertidamente, se coloca a cânula para trás o VNO, a saída também pode fazer com que o vaso sanguíneo VNOevacuar, dando a impressão de uma punção adequada foi realizada. A localização adequada pode ser confirmada através da incorporação de um corante na solução de Ringer. Quando a cânula está devidamente colocado, o corante só deve sair pela entrada VNO. Além disso, pode-se confirmar o posicionamento adequado, garantindo que a cânula é facilmente visível através do aspecto medial semi-transparente do VNO.
12. Mova a prancha plástico lentamente até a AOB é o fluxo direto do padrão aCSF, tomando cuidado para não deslocar a cânula do VNO. A dissecção é completa e avaliação da função fisiológica pode começar imediatamente. Passo 5 descreve brevemente uma abordagem para fazer essa avaliação.

5. Avaliação

1. Penetram na superfície da AOB com 2-4 mohms microeléctrodo de vidro de borosilicato ligado a um amplificador e extracelular osciloscópio.
2. Lentamente avançar o microeléctrodo a uma profundidade de 100-200 mM dosuperfície a uma taxa de 50 mm / min. NOTA: Nesta profundidade tecido, um vai encontrar ocasionais ação espontânea potenciais ondas exemplificadas por breves (~ 1-2 ms) deformações acentuadas, na tensão de microeletrodos.
3. Ao encontrar uma potencial onda de ação, parar o avanço do microeletrodos.
4. Observe e / ou gravar a taxa potencial de ação ao alterar a solução de entrega de estímulo do controle de Ringer a um ativador conhecido da atividade VSN (por exemplo, solução de Ringer contendo KCl 50 mM). Se a dissecção foi bem sucedida, uma mudança dependente do estímulo da taxa potencial de ação ou potencial de campo local pode ser observada. NOTA: Nem todos os neurônios AOB vai responder a cada estímulo com um aumento na taxa de disparo (incluindo solução de Ringer contendo KCl 50 mM). Uma diminuição dependente do estímulo na taxa de disparo também indica a conectividade funcional e uma dissecção de sucesso. No caso em que dois ou mais neurónios que são encontradosnão respondem à estimulação VNO, ou se há potenciais de ação são observados após várias penetrações eletrodo, isso sugere uma dissecção sem sucesso. Se este for o caso, uma nova dissecção pode ser iniciada no passo 3.

Resultados

Alcançar o sucesso com esta preparação requer prática extensa, e tem várias fases em que ele pode falhar. Deve-se esperar para exigir várias tentativas antes de alcançar o sucesso. A câmara de dissecção personalizada é necessária para a conclusão bem sucedida deste protocolo, e deve ser obtido antes de iniciar os estágios mais avançados da dissecção. A concepção da câmara apresentada na Figura 1 é suficiente para esta finalidade, e pode ser feito de materiais plásticos relativament...

Discussão

O VNO-AOB ex preparação vivo descrito neste protocolo é uma alternativa útil para anestesiados in vivo ^5-7 e fatia vivo agudo ¹⁷ experimentos de função AOB. Ao contrário de experimentos fatia AOB agudas, que também expõem elementos do circuito para registros eletrofisiológicos e ópticos, esta preparação mantém todos os aferentes sensoriais e conexões intra-AOB. Embora isso também pode ser dito de anestesiado em abordagens in vivo, a prese...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight Scissors	Fine Science Tools	14002-14
Fine Scissors-Straight	Fine Science Tools	14060-10
Fine Scissors-Curved	Fine Science Tools	14061-10
Adson Forceps	Fine Science Tools	11006-12
#3 Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
#11 Scalpel Blades	Fisher Scientific	3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades	Fisher Scientific	12-640
35 mm Petri Dish	Fisher Scientific	08-772-21
Dissection Chamber	Custom	N/A	See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm	Custom	N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease	Fisher Scientific	146355D
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip	Fine Science Tools	11295-10
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08
1/16" Male Luer	Cole-Parmer	EW-45505-00
1/16" Tubing	Fisher Scientific	14-171-129
Two ton epoxy	Grainger	5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit	AutoMate Scientific	09-16
ValveLink digital/manual controller	AutoMate Scientific	01-18
NaCl	Sigma-Aldrich	various
KCl	Sigma-Aldrich	various
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	various
MgCl2 hexahydrate	Sigma-Aldrich	various
NaHCO3	Sigma-Aldrich	various
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	various
myo-inositol	Sigma-Aldrich	various
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	various
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	various
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	various
Glucose	Sigma-Aldrich	various